2.11.血漿中硫化氫水平及紅細胞中硫化氫生成的測定

取40μl血漿與62.5μl醋酸鋅（1%，w/v）及100μl蒸餾水混合，室溫孵育10分鐘后加入62.5μl三氯乙酸（10%），在4°C下以14,000×g離心10分鐘。收集上清液并與含有N，N-二甲基對苯二胺硫酸鹽（2 M）和氯化鐵（3 M）的30μl緩沖液在1.2 M鹽酸中混合20分鐘。使用Cytation 3成像讀數器（BioTek）測量650 nm處的吸光度。為確定紅細胞產生硫化氫的實時動力學，采用與Unisense PA2000放大器耦合的微型硫化氫電極（型號H2S-MRCh，丹麥奧胡斯Unisense公司）進行實驗，紅細胞樣本經含蛋白酶抑制劑（羅氏）的冰凍/解凍處理后，于4°C以12,000轉/分鐘離心15分鐘。將1 ml分析緩沖液（含1 mM L-半胱氨酸和2 mM吡哆醛-5′-磷酸鹽的PBS）置于37°C的溫控微呼吸腔室（Unisense）內，該腔室位于接地良好的法拉第籠中。為避免硫化氫自發氧化，使用氮氣對呼吸腔室內的分析緩沖液進行脫氧。待硫化氫電極信號穩定后，向腔室內注入10-20 mg 50μl紅細胞蛋白溶液，并記錄硫化氫的實時生成軌跡。硫化氫生成速率在每條軌跡初始最陡斜率處測定。

2.12.紅細胞膜和胞質蛋白的分離以及血紅素濃度的測定

使用Mem-PER Plus膜蛋白提取試劑盒（貨號89842，賽默飛世爾科技）按照制造商的說明分離用于測定BPGM和血紅素水平的紅細胞膜和胞質蛋白。步驟如下：從200μl小鼠或人血中新鮮分離紅細胞。用細胞洗滌溶液洗滌紅細胞樣品后，將細胞重懸于細胞洗滌溶液中，并在4°C下以300×g離心5分鐘。向細胞沉淀中加入透化緩沖液，渦旋混合，并在4°C下持續混合孵育10分鐘。然后，將透化細胞在4°C下以20,000×g離心15分鐘。收集上清液（含胞質蛋白）并轉移至新管中。將沉淀與增溶緩沖液混合，渦旋，在4°C下持續混合孵育30分鐘，然后在4°C下以20,000×g離心15分鐘。收集上清液（含膜蛋白）并轉移至新管中。通過蛋白質印跡法測定胞質和膜提取物中的BPGM水平。

膜組分中的血紅素濃度測定參照先前描述的方法進行。取20μl膜蛋白溶液與1 ml甲酸混合，渦旋1分鐘，然后在14,000×g下離心。收集上清液并與100μl 5 M NaOH混合。通過在1小時內測量其在398 nm處的吸光度來確定膜蛋白溶液中的血紅素含量，并與溶解于相同濃度甲酸中的人血紅蛋白繪制的標準曲線進行比較。

2.13.胞質中BPGM活性的測定

胞質的分離參照文獻方法并稍作修改。將新鮮分離的紅細胞在冷的洗滌緩沖液（5 mM Na?HPO?，pH 8.0，含0.9%NaCl）中洗滌三次。用5 mM Na?HPO?緩沖液（pH 8.0）處理細胞，并在4°C下以20,000×g離心20分鐘。立即收集上清液用于測量BPGM活性。

BPGM活性的測定參照先前描述的方法進行。將紅細胞的胞質提取物在100μl反應混合物中于30°C孵育20分鐘，該反應混合物包含100 mM三乙醇胺（pH 7.6）、1 mM MgSO?、4 mM ATP、3 mM 3-磷酸甘油酸和10 U磷酸甘油酸激酶。然后通過加入25μl三氯乙酸終止反應，并在10,000×g下離心5分鐘。取100μl上清液與17μl 1.8 M Tris堿混合，并使用2,3-BPG試劑盒測定2,3-BPG水平。

2.14.免疫共沉淀

將紅細胞在含有蛋白酶抑制劑混合物和蛋白酶抑制劑（羅氏）的RIPA裂解緩沖液（碧云天）中裂解，然后在冰上孵育2小時。離心后，將上清液與針對BPGM的抗體或band 4.2抗體（Aviva Systems Biology）在4°C下輕柔旋轉孵育過夜，然后加入蛋白A和G瓊脂糖珠（Santa Cruz Biotechnology），并在4°C下繼續孵育3小時。免疫復合物洗滌四次。收集最終沉淀物用于蛋白質印跡分析。使用兔IgG抗體作為陰性對照。同時收集BPGM的沉淀物用于LC-MS/MS分析，以鑒定與BPGM相互作用的潛在蛋白。

2.15.紅細胞中BPGM的免疫熒光染色

將小鼠和人紅細胞用冰冷的甲醇固定10分鐘。用PBS洗滌細胞兩次后，將細胞在室溫下用含1%BSA的PBS（pH 7.4）封閉1小時。將細胞與抗BPGM單克隆抗體（1:100；Santa Cruz Biotechnology）在4°C下孵育過夜。用PBS洗滌三次后，將細胞與Alexa Fluor 488驢抗小鼠IgG（1:1000；Life Technologies）在室溫避光條件下孵育1小時。然后將細胞用PBS洗滌三次并重懸于PBS中。將細胞涂片于載玻片上，在暗處干燥。載玻片用蓋玻片封片，并在共聚焦顯微鏡（Zeiss LSM 780，Zeiss Inc.，耶拿，德國）下觀察。

2.16.紅細胞血影細胞與血影膜測定的制備

2.16.紅細胞血影細胞與血影膜測定的制備。紅細胞血影細胞的制備方法參照先前文獻，取人或小鼠新鮮血液。紅細胞經分離后用4°C的PBS洗滌三次，隨后在含蛋白酶抑制劑混合物（Roche）和1 mM EDTA的5 mM磷酸鹽緩沖液（pH 8.0）中裂解。裂解后的細胞在4°C下以20,000×g離心20分鐘，收集沉淀并用磷酸鹽緩沖液洗滌七次以獲得血影細胞。血影膜測定按先前方法進行。直徑3.17μm的非多孔二氧化硅（二氧化硅）微球購自Bangs Laboratories（美國費舍爾）。二氧化硅微球的制備步驟如下：用6 ml緩沖液（30%過氧化氫/30%氫氧化銨/水：1/1/5）處理微球并超聲5分鐘，隨后在60°C下孵育30分鐘。接著用Millipore水（pH 5.5）洗滌微球5次，再用磷酸鹽緩沖液（5 mM，pH 8.0）洗滌3次。微球被血影細胞包被，從而形成內翻膜（IOM）。IOM用磷酸鹽緩沖液（5 mM，pH 8.0）輕柔洗滌6次。將5×10?個IOM微球加入100μl 5 mM磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中，其中含100μM人或小鼠血紅蛋白、不同濃度的GYY4137和/或碘乙酰胺（Sigma-Aldrich）。微球在37°C下孵育30分鐘，隨后以500×g離心1分鐘。收集上清液進行BPGM活性測定，同時用磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）洗滌沉淀的磁珠6次。將這些磁珠加入100μl濃甲酸（Sigma-Aldrich）中，渦旋混合5分鐘。隨后以500×g離心2分鐘。收集上清液以測定血紅素濃度。