摘要

井岡霉素A(Val-A)是由鏈霉菌產生的次級代謝產物，在農業上廣泛應用于防治水稻紋枯病、稻曲病和猝倒病。本研究探討了堿性pH沖擊對提高Val-A產量的影響及其機制。通過使用氫氧化鈉進行一次或多次沖擊處理，獲得了更高的Val-A產量，同時伴隨更快的蛋白質合成和糖消耗，堿性pH沖擊可使Val-A產量提高27.43%。與氨基酸代謝、碳代謝和電子呼吸鏈相關的基因轉錄顯著上調，同時呼吸活性和谷氨酸濃度大幅增加。Val-A產量的提高是通過一系列復雜機制實現的，并響應了pH脅迫信號，這導致了谷氨酸代謝和呼吸活性的增強。所獲得的信息將有助于未來提高抗生素產量的研究以及分子機制的深入揭示。

1.引言

井岡霉素A(Val-A)是由工業菌株吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)5008發酵產生的抗真菌抗生素，已在東亞地區廣泛用作防治水稻紋枯病、稻曲病和猝倒病的首要藥劑。提高Val-A產量已引起廣泛關注，但似乎對提高生產率收效甚微。pH是微生物代謝的綜合反映，因此影響發酵過程和細胞生長。pH可影響代謝方向，并且不同階段生長和產物合成的最適pH也不同。相同的微生物在不同的環境pH條件下可能產生不同的代謝產物。例如，黑曲霉(Aspergillus niger)在pH 2-3下發酵蔗糖主要產生檸檬酸，但當pH變為7時，主要產生草酸(Lu et al.,2016)。因此，在發酵過程中，采用適當的策略控制pH可以獲得所需產物。

發酵pH對鏈霉菌發酵也有很大影響，其中一些菌株具有特定的響應措施。不同抗生素的合成需要不同的pH，即使是同一種抗生素，在不同培養階段也需要不同的pH才能獲得最高產量。根據Chan的研究(Chan et al.,2015)，提出了一種兩階段pH控制策略，即在培養112小時后將培養pH從5.5轉變為5.8，以提高恩拉霉素(enduracidin)的產量，生產率提高了51.2%。再比如，通過基于原位pH監測的種子階段開發，ε-聚-L-賴氨酸(ε-poly-L-lysine)的產量最多提高了36.6%(Sun et al.,2015;Xu et al.,2015)。

環境脅迫一直是提高鏈霉菌次級代謝產物的關鍵途徑，環境信號可以通過啟動復雜的轉導系統來提高次級代謝產物的產量(Li et al.,2016)。鏈霉菌根據不同類型的環境因素，擁有許多獨特的信號轉導機制。在天藍色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)中，pH沖擊誘導了放線紫紅素(actinorhodin)的調控基因和生物合成基因的過表達(Kim et al.,2007,2008)。此外，在鏈霉菌(Streptomyces sp.)CK4412中，推定的酸沖擊誘導基因SCO7832的表達通過途徑特異性調控基因的過表達刺激了tautomycetin的產量(Park et al.,2009)。此外，雙組分調控系統(two-component regulatory system)也是一種非常重要的調控方式。據報道，雙組分系統DraR/DraK參與了天藍色鏈霉菌中抗生素生物合成的調控(Yeo et al.,2013)。在白色鏈霉菌(Streptomyces albulus)M-Z18中，研究了其對酸性pH以實現高產ε-聚-L-賴氨酸的生理響應，與轉錄調控、脅迫響應蛋白、轉運蛋白、細胞壁和細胞膜、次級代謝產物生產、DNA和RNA代謝以及核糖體亞基相關的基因在酸性pH響應中起主要作用(Ren et al.,2015)。然而，關于pH沖擊對Val-A產量及生物合成途徑基因表達影響的信息很少，而這些信息對于改進抗生素發酵和降低成本具有重要價值。直到最近，我們首次采用堿性pH沖擊來增強Val-A產量，并初步確定用于pH沖擊的適宜pH約為8.0(Zhou et al.,2016)。

本工作旨在研究pH沖擊對Val-A發酵過程的影響，并揭示pH與Val-A產量之間的關系。基于吸水鏈霉菌S.hygroscopicus 5008在不同pH沖擊條件下合成Val-A的產量變化規律以及最新的基因組研究進展，研究了pH對基因表達的影響及其在生理水平上的規律，以探索pH沖擊提高Val-A產量的機制。首先，選擇pH作為環境脅迫來提高Val-A產量，進行了代謝活性分析，并構建了包含pH沖擊的高效發酵策略。此外，依次探討了pH沖擊對基因表達和細胞微環境的影響。最后，全面討論了pH沖擊對Val-A產量的作用機制。據我們所知，這是在Val-A發酵上采用環境脅迫的首次嘗試。它也可為其他放線菌生產抗生素提供良好的參考。