2.4.血液采集、紅細胞制備及體外處理

使用肝素作為抗?凝劑采集人和小鼠的血液樣本。采集后30分鐘內(nèi)，于4°C以1500×g離心5分鐘。隨后通過吸出血漿和白色界面收集紅細胞。收集的紅細胞加載于70%Percoll（GE Health?care，瑞典烏普薩拉）上，再以1500×g離心20分鐘。紅細胞沉淀用10倍體積的冰PBS洗滌三次。測定紅細胞蛋白濃度后，將紅細胞樣本分裝并儲存在-80°C。新鮮分離的紅細胞用F-10營養(yǎng)混合液（Life Technologies）洗滌三次，隨后用F-10培養(yǎng)基重懸至2572%的血細胞比容。細胞接種于六孔培養(yǎng)板，加入GYY4137（250-500μM），隨后在5%二氧化碳和95%空氣的環(huán)境中輕輕搖動孵育指定時間。

2.5.代謝組學(xué)分析

如前所述，從10只雄性野生型（WT）小鼠和10只雄性Cse?/?小鼠中收集純化的紅細胞（RBC）樣本。紅細胞的代謝組學(xué)分析由上海應(yīng)用蛋白質(zhì)技術(shù)有限公司（中國上海）采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）完成。將紅細胞樣本在冰上解凍，并用預(yù)冷的裂解/提取緩沖液（甲醇:乙腈:水=2:2:1）進行提取。樣本在4°C下超聲處理30分鐘，隨后在–20°C孵育1小時，再于4°C以14,000×g離心15分鐘。收集上清液，并通過真空離心濃縮儀（SpeedVac）干燥。隨后將干燥樣品用分析緩沖液（乙腈:水=1:1）復(fù)溶。分析采用超高效液相色譜系統(tǒng)（UHPLC，Agilent 1290 Infinity LC）與四極桿飛行時間質(zhì)譜儀（AB Sciex TripleTOF 6600）聯(lián)用進行。紅細胞提取物在ACQUITY UPLC BEH 1.7μm色譜柱（2.1 mm×100 mm，Waters公司，愛爾蘭）上進行分離。在自動MS/MS采集模式下，儀器設(shè)定在m/z 25–1000 Da范圍內(nèi)采集數(shù)據(jù)，產(chǎn)物離子掃描的累積時間設(shè)為0.05秒/譜圖。產(chǎn)物離子掃描采用信息依賴采集（IDA）模式，并選擇高靈敏度模式。原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)（wiff.scan文件）使用ProteoWizard的msConvert工具轉(zhuǎn)換為mzXML格式，隨后導(dǎo)入免費的XCMS軟件進行處理。代謝物的鑒定通過比對MS/MS譜圖與實驗室內(nèi)部建立的、包含已知標準品的數(shù)據(jù)庫完成。隨后，利用KEGG通路數(shù)據(jù)庫進行功能富集分析。

2.6.氧離曲線測定

紅細胞及血紅蛋白（Hb）的氧離曲線使用Hemox分析儀（TCS Scientific Corporation，美國賓夕法尼亞州New Hope）進行測定，取10μl全血或10μl濃度為10?/μl的紅細胞懸液，與4.5 ml Hemox緩沖液（TCS Scientific Corporation）、10μl消泡劑（TCS Scientific Corporation）以及20μl溶于PBS的22%牛血清白蛋白（BSA）混合。將混合液注入Hemox分析儀中，在37°C下按照制造商說明書測定氧平衡曲線。人和小鼠血紅蛋白的氧離曲線也以類似方式測定。

2.7.血紅蛋白的制備

人血紅蛋白購自Sigma-Aldrich公司。小鼠血紅蛋白則從新鮮小鼠血液中純化獲得。將全血分離得到紅細胞后，在pH 8.0的裂解緩沖液（含5 mM磷酸鈉、1 mM EDTA和30μg/ml PMSF（Thermo Fisher Scientific，美國伊利諾伊州Rockford））中溶血，并于4°C以40,000×g離心20分鐘。收集上清液，并在Sephadex G-100凝膠過濾柱上用0.1 M NaCl進行純化。洗脫液隨后在0.01 M HEPES緩沖液（pH 7.7）中透析過夜（緩沖液體積超過樣品40倍以上），以去除2,3-二磷酸甘油酸（2,3-BPG）及其他調(diào)節(jié)配體。

人和小鼠血紅蛋白均用含10 mM連二亞硫酸鈉（Sigma-Aldrich）的100 mM焦磷酸四鈉緩沖液（pH 8.3）進行還原處理。還原后的血紅蛋白經(jīng)Econo-Pac 10DG脫鹽柱（Bio-Rad，美國加利福尼亞州Hercules）純化，該柱預(yù)先用含氧的HEPES緩沖液平衡，以去除過量的連二亞硫酸鈉并形成氧合血紅蛋白（oxy-Hb）。

2.8.血壓測定

對妊娠大鼠進行麻醉（腹腔注射800 mg/kg氨基甲酸乙酯和40 mg/kgα-氯醛糖），隨后進行右側(cè)頸動脈插管。使用PowerLab系統(tǒng)（ADInstruments，澳大利亞）測定收縮壓（SBP）。

2.9.蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）分析

組織和紅細胞中目標蛋白的Western Blot分析參照先前研究進行。對于紅細胞樣本，先用預(yù)冷PBS洗滌三次，隨后通過反復(fù)凍融5次進行裂解，并于4°C以12,000×g離心15分鐘。收集上清液用于后續(xù)Western Blot分析。蛋白濃度通過280 nm處的吸光度測定。組織樣本則用預(yù)冷的RIPA裂解緩沖液（碧云天，中國江蘇）裂解，同樣于4°C以12,000×g離心15分鐘，收集上清液。蛋白濃度采用Pierce?BCA蛋白定量試劑盒（Thermo Fisher Scientific，美國馬薩諸塞州）測定。隨后，將組織或細胞提取物與4×上樣緩沖液（含250 mmol/L Tris-HCl、10%SDS、0.5%溴酚藍、50%甘油和7.5%DTT，pH 6.8）混合。上樣前，樣品于99°C加熱10分鐘。樣品經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜（Millipore Corp.，美國馬薩諸塞州Bedford）。膜在封閉緩沖液（含0.1%Tween-20和5%脫脂奶粉的Tris緩沖鹽溶液）中室溫封閉2小時，隨后于4°C與以下一抗孵育過夜：抗BPGM抗體（Santa Cruz Biotechnology；貨號sc-373819）、抗血紅蛋白抗體（Abcam；貨號ab-191183）、抗Band 4.2抗體（Aviva Systems Biology；貨號ABIN214102）或抗β-actin抗體（Abcam；貨號ab-8226）。室溫下與辣根過氧化物酶標記的二抗（Santa Cruz Biotechnology）孵育1小時后，使用增強化學(xué)發(fā)光（ECL）Western Blot檢測試劑系統(tǒng)（Millipore）顯影。膜上的化學(xué)發(fā)光信號通過GeneGnome HR掃描儀及GeneTools軟件（SynGene）進行定量分析。

2.10.2,3-BPG的測定

紅細胞中的2,3-BPG被提取，并使用市售試劑盒（Roche，Nutley，NJ），將紅細胞沉淀加入冰上0.6 M冰凍高氯酸，渦旋混合，隨后超聲處理10秒。接著將勻漿液在4°C下以20,000×g離心10分鐘。收集上清液并用10 ml 2.5 M碳酸鉀中和，再次在4°C下以20,000×g離心5分鐘。收集上清液后，使用2,3-BPG試劑盒按制造商手冊定量2,3-BPG濃度。