3.6 H2-MBs減少心肌炎癥和氧化應激損傷。

使用ELISA分析檢測了缺血30分鐘和再灌注24小時后產(chǎn)生的關鍵促炎和氧化應激細胞因子。結果顯示，接受載體處理的大鼠的所有檢測到的細胞因子均顯著增加，與假動物相比（P<0.05）。相比之下，接受H2-MB處理的大鼠顯示出不同程度的減少心肌炎癥和氧化損傷。與接受載體處理的動物相比，接受H2-MBs的大鼠的MPO減少了28.0％（P<0.05）（圖6a），心肌裂解物中TNF-α和IL-1β水平的評估顯示H2-MB處理的大鼠分別減少了39.0％和14.5％與接受載體處理的組相比（P<0.01）（圖6b，c）。此外，心肌組織勻漿中的前氧化細胞因子ELISA分析顯示，接受H2-MBs的大鼠的8-OHdG水平顯著降低，與接受載體處理的動物相比（115.78±10.88 vs 88.31±6.34 ng/mg蛋白）（P<0.01）（圖6d）。H2-MB處理組中心肌組織中的MDA水平顯示出類似的變化，比載體處理組低12.16％（P<0.05）（圖6e）。

圖6.心肌促炎和促氧化細胞因子以及ROS的ELISA分析。從接受假手術處理、車輛處理或H2-MB處理的大鼠獲得心臟組織勻漿，這些大鼠經(jīng)歷了30分鐘的缺血和24小時的再灌注，以分析產(chǎn)生的心肌促炎和促氧化細胞因子。為了檢測ROS，在經(jīng)歷30分鐘缺血后，大鼠在再灌注40分鐘前靜脈注射了載體或H2-MBs。所有檢測的心肌促炎和促氧化細胞因子的水平在心肌缺血再灌注后均增加，但在大鼠接受H2-MBs后，這些水平以不同程度降低。(a?c)然后檢測了包括MPO、TNF-α和IL-1β在內的促炎細胞因子水平（n=6）。*P<0.05，**P<0.01。數(shù)據(jù)表示平均值±s.d。(d,e)檢測了促氧化劑8-OHdG和MDA細胞因子的水平（n=6）。*P<0.05，**P<0.01。數(shù)據(jù)表示平均值±s.d。(f?i)通過測量它們與HPF、DAF-2、NBT或CM-H2DCFDA的反應性來檢測勻漿中自由基（?OH、NO?、O2??）和H2O2的水平。使用自動微板讀數(shù)器測定熒光強度，具體描述見方法部分（n=3）。*P<0.05，**P<0.01。數(shù)據(jù)表示平均值±s.d.

3.7 H2-MBs選擇性減少羥自由基。

其他研究表明，H2可以選擇性地減少細胞內的細胞毒氧自由基并中和羥自由基（?OH）。因此，我們進一步研究了H2-MBs是否能夠有效減少缺血30分鐘和再灌注40分鐘后心肌組織AAR中的ROS。與接受載體處理的大鼠相比，H2-MB處理的大鼠在40分鐘再灌注后顯示出羥自由基水平顯著降低（P<0.05）（圖6f）；然而，心肌裂解物中NO?、O2??和H2O2水平的評估顯示所有組之間沒有差異（P>0.05）。

3.8 H2-MBs具有良好的生物相容性。

進行了毒理學分析，以檢測H2-MBs是否對健康大鼠有毒。血液分析，包括完全血細胞計數(shù)，表明靜脈注射H2-MBs后3或7天的血細胞計數(shù)值均在正常范圍內（表S2）。此外，還對心臟、脾臟、肝臟、肺臟和腎臟進行了組織學檢查，結果顯示H2-MBs對這些器官沒有產(chǎn)生不良影響（圖S7）。此外，注射H2-MBs的大鼠未觀察到異常行為，表明H2-MBs具有良好的生物相容性，對大鼠無毒。

4討論

目前，尚無可用于預防心血管疾病的圖像引導型H2輸送系統(tǒng)。在本研究中，我們設計了H2-MBs用于超聲引導的治療性H2輸送系統(tǒng)，以促進治療載體實時和可視化地輸送到心肌組織。該輸送系統(tǒng)有望為將治療性氣體治療從基礎科學轉化為臨床應用奠定基礎。

在我們當前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)當使用MBs封裝H2時，每單位體積溶液中的H2含量更高（C3F8/H2=1:1時大約高出3倍）比使用H2飽和的生理鹽水（在0.4 MPa壓力下溶解H2）時，這意味著H2-MBs可以大大提高單位體積溶液中的H2溶解度。這種方法有潛力通過增加H2-MBs的數(shù)量而不是增加壓力或體積來輕松實現(xiàn)有限體積溶液中的更高H2濃度。此外，在我們的體外和體內研究中，我們發(fā)現(xiàn)H2-MBs可以有效釋放H2，在PBS中的最大H2水平為180±0.02μmol/L，在大鼠動脈血中為119±0.02μmol/L。值得注意的是，這幾乎是之前研究中觀察到的氫氣濃度的6到10倍，那些研究中大鼠被迫吸入氫氣。在他們的研究中，證據(jù)表明氫通過選擇性減少細胞毒氧自由基直接影響氧化劑，而每毫升動脈血中的20ng H2（相當于10μmol/L濃度）被認為是有效的治療劑量。

超聲成像的數(shù)據(jù)表明H2-MBs可以在聲學激發(fā)下用于成像。MBs的這種獨特聲學特性有助于實時跟蹤H2輸送到心肌組織并監(jiān)測治療氣體的劑量，因為超聲信號強度與H2-MBs的濃度成正比。到目前為止，尚未有關于使用H2的圖像引導型輸送系統(tǒng)用于治療應用的報告。此外，我們的體外和體內成像分析一致表明H2-MBs的濃度與超聲信號強度成正比（圖2）。

來自心肌梗死面積評估和超聲心動圖的數(shù)據(jù)表明，H2-MBs可以有效保護免受心肌缺血再灌注損傷，從而保護LV功能。然后，我們評估了心肌梗死后H2-MBs對心肌細胞凋亡和炎癥的影響。組織學分析顯示，在接受H2-MBs的大鼠的缺血區(qū)域內，出血和凋亡顯著減少，以及caspase-3的表達減少。此外，對炎癥細胞因子的定量分析顯示，與接受載體處理的大鼠相比，接受H2-MBs處理的大鼠的心肌中MPO、TNF-α和IL-1β水平顯著降低。事實上，通過H2的抗炎作用啟動心臟保護已有先前報道。此外，我們的數(shù)據(jù)顯示，H2-MBs的給藥減少了“潛在”梗死區(qū)域中8-OHdG和MDA的水平，這表明H2-MBs的抗氧化作用，至少部分地，是通過ROS清除作用來實現(xiàn)的。對ROS的進一步分析證實了H2-MBs中和有毒ROS的能力。然而，在心肌缺血再灌注損傷后，接受H2-MBs的大鼠心肌組織中的?OH水平下降，而NO?、O2??或過氧化氫（H2O2）的水平?jīng)]有變化。這些結果與先前的研究相符。在生物系統(tǒng)中，羥自由基是ROS中最具反應性的產(chǎn)物，通過Haber-Weiss反應從過氧化物陰離子生成，或通過Fenton反應從H2O2生成。因此，開發(fā)的智能H2-MBs作為一個平臺，具有在醫(yī)學應用中作為安全有效的抗氧化劑，并具有最小副作用的前景。

5結論

總的來說，我們開發(fā)了一種新穎的、圖像引導的治療性H2輸送系統(tǒng)，簡單易用，由此產(chǎn)生的H2-MBs極大地提高了單位體積溶液中的H2溶解度。更重要的是，H2-MBs可以被視覺跟蹤，并用于保護心肌缺血再灌注損傷。我們的研究為基于H2的治療應用的臨床轉化提供了潛在解決方案。