摘要

研究目的：阻塞性睡眠呼吸暫停(OSA)的特點是間歇性缺氧和氧化應激。然而，模擬OSA的間歇性缺氧是否會改變男性的生育能力尚不清楚。我們在小鼠模型中測試了慢性間歇性缺氧模擬OSA會降低男性生育能力的假設。

設計：在小鼠模型中進行病例對照比較。

環境：大學研究實驗室。

參與者：18只F1(C57BL/6xCBA)雄性小鼠。

干預：對小鼠進行為期60天、每天6小時的周期性缺氧(20秒5%氧氣濃度，然后40秒室內空氣濃度)或常氧。60天后，小鼠進行交配試驗，通過評估懷孕雌鼠和胎兒的數量來確定有效生育力。

測量和結果：安樂死后，通過反轉錄聚合酶鏈反應測定谷胱甘肽過氧化物酶1(Gpx1)和超氧化物歧化酶1(Sod1)的表達，評估睪丸的氧化應激。精子活力由精液綜合分析系統(ISAS)測定。間歇性缺氧明顯增加了睪丸的氧化應激，與常氧相比，Gpx1和Sod1的表達分別減少了38.9%和34.4%(P<0.05)。間歇性缺氧組的精子活力從常氧時的27.0±6.4%顯著下降到12.8±1.8%(P=0.04)。間歇性缺氧組的妊娠雌性比例和每次交配的胎兒數(分別為0.33±0.10和2.45±0.73)明顯低于常氧對照組(分別為0.72±0.16和5.80±1.24)。

結論：這些結果表明，與阻塞性睡眠呼吸暫停(OSA)相關的間歇性缺氧可能會導致患有這種睡眠呼吸障礙的男性患者生育力下降。

引言

阻塞性睡眠呼吸暫停(OSA)是一種普遍存在的慢性疾病，尤其是男性。其特點是在睡眠過程中反復發生上氣道完全或部分塌陷。這些呼吸事件會導致間歇性低氧血癥、胸內負壓升高和睡眠破碎。OSA對心血管、新陳代謝、神經認知以及最近的腫瘤等方面的影響已在實驗和臨床層面得到廣泛研究和證實。間歇性缺氧引發的全身和器官特異性氧化應激被認為在OSA中長期后果的形成中扮演了關鍵角色。

在一個完全不同的背景下，人們發現氧化應激是導致越來越多男性不育的主要原因。事實上，吸煙、酗酒、接觸毒素、炎癥過程或多種慢性疾病都會導致全身性氧化應激增強，從而降低男性生育能力。特別是嚴重的呼吸系統功能障礙，如慢性阻塞性肺病或肺泡蛋白沉積癥，與全身低氧血癥有關，也與睪丸功能損害有關。值得注意的是，據報道，在特發性男性不育(約占50%)病例中，精液中活性氧(ROS)的產生量較高，抗氧化能力較低。此外，有證據表明，精子膜上的多不飽和脂肪酸極易被ROS過氧化，而脂質過氧化可導致精子形態改變。事實上，通過量化ROS或總抗氧化能力來評估精液氧化應激是男性不育的獨立預測指標，而低抗氧化能力與精子參數不良有關。

鑒于OSA會誘發氧化應激，而這種挑戰會降低男性的生育能力，因此可以預計OSA的一個潛在后果可能會導致患有這種睡眠呼吸障礙的男性患者的生育能力下降，尤其是在發生相當嚴重的缺氧事件的嚴重病例中。雖然最近有理論依據提出男性生育力低下、肥胖和OSA之間存在聯系，但目前既沒有臨床數據也沒有實驗數據來證實這種潛在的復雜關系。為了驗證OSA誘導的缺氧事件會降低男性生育能力的假設，我們對一個模仿OSA的慢性間歇性缺氧小鼠模型進行了實驗研究。具體來說，我們研究了間歇性缺氧是否會誘發睪丸組織缺氧/再缺氧事件、增強睪丸氧化應激并導致精子活力下降。此外，我們還進行了交配試驗，以確定在模擬嚴重OSA患者的間歇性缺氧模式下，小鼠的雄性生育能力是否真的會下降。

材料與方法

動物。這項研究獲得了巴塞羅那大學動物研究倫理委員會的批準，研究對象是44只無病原體的F1(C57BL/6xCBA)雄性小鼠。這些小鼠被關在標準籠子里，自由飲用自來水和進食，并飼養在溫度和光照受控的房間里(22-24oC，12L：12D)。

應用慢性間歇性缺氧的系統。慢性間歇性缺氧是通過先前描述過的一種設置來實現的。簡言之，通過一個基于多孔的分配系統，持續的氣流在一個盒子(長26厘米、寬18厘米、高6厘米)中循環。放置在箱體入口附近的氣動閥從室內空氣入口(40秒)循環切換到含氧量為5%的低氧空氣儲氣罐(20秒)。因此，對放置在盒子中的小鼠施加的間歇性缺氧頻率相當于每小時60次呼吸暫停，這代表了嚴重的OSA。為了讓對照組小鼠接受常氧呼吸，將這些小鼠放入與間歇性缺氧箱相同的箱中，但用室內空氣代替5%O2的儲氣罐。因此，兩組小鼠的實驗方案完全相同，唯一的區別是呼吸常氧或間歇性缺氧空氣。

睪丸缺氧/復氧測量。在第一組實驗中，我們確定了呼吸間歇性缺氧空氣是否會導致睪丸缺氧復氧。我們對六只12周大的小鼠進行了麻醉(20%氨基甲酸乙酯，1克/千克)，測量了睪丸組織氧分壓(PtO2)。剃除并清潔腹部下層皮膚后，在陰莖下方做一橫向切口以暴露睪丸。在陰囊和睪丸鞘膜處做第二個最小切口，將快速反應克拉克極譜氧微電極UnisenseA/S；直徑50μm)插入睪丸表面下3毫米處。獲得穩定的基線記錄后，用鼻罩間歇性缺氧15分鐘。氧微電極測量PtO2的時間進程，該微電極連接到一個放大的微微安培計(Unisense A/S)，該微微安培計先前在水中以100%O2、21%O2和無氧溶液(NaOH 0.1M、抗壞血酸鈉0.1M)進行過校準，并記錄了PtO2的時間進程(MicOX軟件，UnisenseA/S)。動脈血氧飽和度(SaO2)也是通過脈搏血氧儀測量和記錄的。

間歇性缺氧對睪丸氧化應激和精子活力的影響。第二個實驗系列旨在評估間歇性缺氧30天對幼鼠睪丸組織氧化應激和精子活力的影響。為此，將20只小鼠(12w大)隨機分為兩組(對照組和間歇性缺氧組；每組n=10只)并稱重(常氧組和間歇性缺氧組的體重分別為25.5±0.6g和26.0±0.3g)。將動物放入實驗籠中，每天在光照時間段(10：00-16：00)對其進行6小時的間歇性缺氧或常氧，光照時間段相當于嚙齒動物的睡眠時間。在間歇性缺氧或常氧條件下飼養30天后，小鼠被處以安樂死。將精子從附睪中釋放出來，進行常規精液圖檢查，以測量總活力和漸進活力值。此外，還對精子活力和精子數量進行了分析。為了評估精子的運動能力和漸進運動能力，需要切除睪丸、附睪和輸精管。從輸精管上切除脂肪和靜脈，以避免污染。此外，還切除了睪丸并將其保存在-80oC下，以通過反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)測定谷胱甘肽過氧化物酶1(Gpx1)、超氧化物歧化酶1(Sod1)和過氧化氫酶(Cat)。

通過精液造影測量精子活力。用鑷子從附睪尾部向輸精管末端施加軟壓力，將精子放入裝有500μL M2培養基的35毫米孔中。精子樣本在37oC培養15分鐘，直到精子均勻分布在M2滴中。從液滴表面取25μL樣品(上游動)放在顯微載玻片上，以獲得定量的精子活力變量。使用精液綜合分析系統分析精子運動和精子漸進運動測量結果。該分析使用的參數包括平滑路徑速度、軌跡速度、直線度(直線速度/平均路徑速度之比，VSL/VAP)和側頭擺動幅度，這些參數基于總運動、漸進運動和速度(靜態、中速和慢速精子細胞)。精子計數時，將精子樣本用毫升水稀釋1/10，然后將10μL精子放入Bürker室中，按照標準程序獲得精子細胞濃度(百萬精子/毫升)。使用活/死精子存活率試劑盒，結合活細胞核酸染色法SYBR-14和傳統的死細胞核酸染色法碘化丙啶，測定活精子細胞和死精子細胞的存活率。簡言之，將0.8mL 20mM SYBR-14工作溶液和1.2mL 2.4mM碘化丙啶工作溶液加入50mL精子懸浮液(2-3×106個精子細胞/mL)中，37oC培養15分鐘。15分鐘后，將20mL精子懸浮液裝入玻璃載玻片，蓋上蓋玻片，并立即在裝有適當濾光片的熒光顯微鏡下觀察。SYBR-14可將活精子的細胞核染成綠色，而死精子或膜損傷的精子則會被碘化丙啶染成紅色。