材料與方法

細菌菌株和生長條件

銅綠假單胞菌菌株UCBPP-PA14（Rahme et al.,1995）通常在溶菌肉湯（LB;1%胰蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母提取物）（Bertani,2004）中于37°C、250 rpm振蕩培養，除非另有說明。過夜培養物生長12-16小時。對于遺傳操作，菌株通常在含有1.5%瓊脂的固體LB上生長。本研究中使用的菌株列于表1。通常，液體預培養物用作實驗的接種物。生物學重復的過夜預培養物從劃線瓊脂平板上的單獨克隆源菌落開始。對于技術重復，單個預培養物用作亞培養物的來源接種物。

構建銅綠假單胞菌突變株

為了在銅綠假單胞菌PA14（表1）中構建無標記缺失突變體，使用表2中列出的引物擴增目標基因兩側各1 kb的序列，并通過在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）InvSc1中的間隙修復克隆（gap repair cloning）插入pMQ30（Shanks et al.,2006）。表3中列出的每個質粒都轉化到大腸桿菌（Escherichia coli）菌株UQ950中，通過限制性酶切驗證，并使用雙親結合（biparental conjugation）轉移到PA14中。在含有100μg/ml慶大霉素的LB瓊脂平板上選擇PA14單交換重組子。在無NaCl并修改為含10%蔗糖的LB上選擇雙交換重組子（無標記缺失）。通過PCR確認缺失突變體的基因型。組合突變體是通過使用單突變體作為雙親結合的宿主來構建的，除了Dcco1cco2，它是通過同時將cco1和cco2操縱子作為一個片段刪除來構建的。使用表2中列出的引物LD438和LD441擴增ccoN4的編碼序列，測序驗證后，以相同方式將ccoN4互補回缺失位點。

菌落生物膜形態分析

過夜預培養物按1:100稀釋于LB（△N1ΔN2、△N1ΔN2ΔN3、△N1ΔN2△N4、ΔN1ΔN2ΔN4ΔN3、ΔN1ΔN2ΔN4::N4、Δcco1cco2、ΔN1ΔN2Δhcn、ΔN1ΔN2ΔN4△hcn和△cox△cyoAcio按1:50稀釋）并生長至中期指數相（OD500nm≈0.5）。將10微升亞培養物點種到含有60毫升菌落形態培養基（1%胰蛋白胨，1%瓊脂[Teknova(Hollister,CA)A7777]，含40μg/ml剛果紅染料[VWR(Radnor,PA)AAAB24310-14]和20μg/ml考馬斯亮藍染料[VWR EM-3300]）的10厘米x 10厘米x 1.5厘米方形培養皿（LDP[Wayne,NJ]D210-16）中。對于生長在吩嗪甲酯硫酸鹽（PMS）上的生物膜制備，在高壓滅菌后向菌落形態培養基中加入200μM PMS（Amresco[Solon,OH]0361）。對于硝酸鹽實驗，菌落形態培養基中加入0、10或40 mM硝酸鉀。平板在25°C、>90%濕度（Percival[Perry,IA]CU-22L）下孵育長達5天，并使用VHX-1000數碼顯微鏡（Keyence,Japan）每天成像。顯示的圖像代表了至少10個生物學重復。使用Keyence VR-3100大面積3D測量系統在第5天拍攝生物膜的3D圖像。△cox△cyo△cio、hcn缺失突變體和用于硝酸鹽實驗的菌株使用平板掃描儀（Epson[Japan]E11000XL-GA）成像，代表了至少三個生物學重復。

TTC還原測定

將過夜培養物（五個生物學重復）點種1微升到含有0.001%（w/v）TTC（2,3,5-三苯基氯化四氮唑[Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)T8877]）的1%胰蛋白胨、1.5%瓊脂平板上，并在25°C黑暗中孵育24小時。使用掃描儀（Epson E11000XL-GA）對斑點進行成像，并使用Adobe Photoshop CS5（San Jose,CA）量化TTC還原情況（歸一化至菌落面積）。無色的TTC在還原時經歷不可逆的顏色變化變為紅色。

液體培養生長試驗

(i)在透明平底聚苯乙烯96孔板(VWR82050-716)中將隔夜前培養物以1:100稀釋(ΔN1ΔN2、ΔN1ΔN2ΔN4和Δcco1cco2以1:50稀釋)，并培養兩小時(OD500nm"0.2)。然后將這些培養物在新的96孔板中用1%胰蛋白胨稀釋100倍，并在Synergy4平板閱讀器的培養基設置下于37℃溫度下連續振蕩培養。在至少24小時內，每隔30分鐘在500納米處讀取一次OD值來評估生長情況。(ii)hcn突變體：過夜前培養物以1:100稀釋(ΔN1ΔN2Δhcn、ΔN1ΔN2ΔN4Δhcn和Δcco1cco2Δhcn稀釋為1:50)，在MOPS最小培養基(50mM 4-morpholine-propanesulfonic acid(pH7.2)、43mM NaCl、93mM NH4Cl、2.2mM KH2PO4、1mM MgSO4·7H2O、1mg/ml FeSO4·7H2O、20mM六水合琥珀酸鈉)中，培養2.5小時，直至500納米波長處的OD值=0.1。然后將這些培養物在MOPS極少量培養基中稀釋100倍，置于透明平底聚苯乙烯96孔板中，在37℃溫度下培養，并在平板閱讀器的培養基設置下持續振蕩。在至少24小時內，每隔30分鐘在500納米處讀取一次OD值，以評估生長情況。(iii)終止氧化酶報告物：過夜前培養物以生物三聯培養；每個生物三聯培養物以技術二聯培養。過夜前培養物在1%胰蛋白胨中以1:100稀釋，培養2.5小時，直到500納米處的OD值為0.1。然后將這些培養物在1%胰蛋白胨中稀釋100倍，裝入透明平底黑色聚苯乙烯96孔板(VWR82050-756)中，在37℃溫度下培養，并在平板閱讀器的培養基設置下持續振蕩。在24小時內，每小時分別在480納米和510納米的激發波長和發射波長下讀取熒光值，以評估GFP的表達。在24小時內，每隔30分鐘在500納米波長處讀取一次OD值，以評估生長情況。將技術復制的生長和RFU值取平均值，得出每個生物重復的相應值。沒有在gfp基因上游插入啟動子的菌株(MCS-gfp)的RFU值被視為背景值，并從每個報告基因的熒光值中減去。