4.ZnPBA NCs的殺菌性能。

細菌清除是細菌性肺炎治療過程中消除持續(xù)感染和伴隨炎癥的最基本要求之一。因此，我們研究了ZnPBA NCs的抗菌能力。研究采用了四種典型的誘發(fā)肺炎的細菌即大腸埃希菌（E.coli）、金黃色葡萄球菌（S.aureus）、肺炎克雷伯菌（K.pneumoniae）和銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）。在體外抗菌實驗中，每種細菌在接種后2小時內(nèi)與不同濃度的5-100μg/ml ZnPBA NCs培養(yǎng)6小時。然后將剩余的存活細菌細胞接種到瓊脂平板中進行細菌計數(shù)。

展出ZnPBA NCs對正在研究的所有這些類型的細菌具有濃度依賴性的抗菌性能。低劑量的ZnPBA NCs可有效根除金黃色葡萄球菌（41.87±2.97%的細菌殘留于10μg/ml，p<0.05）、肺炎克雷伯菌（32.61±1.44%的細菌殘留于5μg/ml，33.45±6.41%的細菌殘留于10μg/ml，p<0.05）和銅綠假單胞菌（49.23±1.21%的細菌殘留5μg/ml，34.10±7.02%的細菌殘留10μg/ml，p<0.01）;而殺死大腸桿菌的效果較差（分別為86.70±4.67%和74.40±3.92%的細菌殘留在5和10μg/ml的ZnPBA NCs添加中）（圖5a-d）。

高劑量的ZnPBA NCs具有更強的抗菌性能。當ZnPBA NCs的劑量為100μg/ml時，四種細菌的殘菌率低于15%(大腸埃希菌殘留率為9.27±2.28%，P<0.01；金黃色葡萄球菌殘留率為4.34±3.28%，P<0.001；肺炎克雷伯菌殘留率為11.10±2.11%，P<0.001；銅綠假單胞菌殘留率為11.79±2.13%，P<0.01)，表明其具有良好的廣譜抗菌能力。

為了探索ZnPBA NCs的殺菌機制，采用TEM觀察了大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌和銅綠假單胞菌經(jīng)ZnPBA NCs不同處理后的形態(tài)。在對照組中，四種細菌保持了完整的細菌形態(tài)，細胞膜和細胞質(zhì)完整無缺（圖5e）。用100μg/ml的ZnPBA NCs殺菌6小時后，在TEM圖像中很容易觀察到異常的細胞膜和細胞質(zhì)內(nèi)容物外流，證明ZnPBA NCs通過直接破壞細胞膜實現(xiàn)了廣譜抗菌能力。ZnPBA NCs能有效地誘導(dǎo)對細菌膜的破壞，從而引發(fā)細胞質(zhì)的滲漏，進而導(dǎo)致細菌死亡。

5.ZnPBA NCs的體內(nèi)生物相容性。

在進行細菌性肺炎治療藥物的體內(nèi)研究之前，先在8周大的ICR雌性小鼠身上評估了ZnPBA NCs的體內(nèi)生物相容性。所有動物實驗均在上海市第十醫(yī)院實驗動物倫理委員會的指導(dǎo)下進行。雌性ICR小鼠（6周齡）。20只雌性ICR小鼠隨機分為四組（n=5）：對照組（未處理）、PBS組（氣管內(nèi)灌注25μl PBS）、ZnPBA NCs-iv組（靜脈注射100μl 200μg/ml ZnPBA NCs）和ZnPBA NCs-it組（氣管內(nèi)灌注25μl ZnPBA NCs，200μg/ml），其中ZnPBA NCs的劑量是治療用量的兩倍。

在24天的評估期間，PBS，ZnPBA NCs-iv小鼠的病理體重變化沒有明顯變化。在評估期結(jié)束時，對包括心、肝、脾、肺和腎在內(nèi)的主要器官進行取樣，并用H&E染色進行病理分析。所有研究組均未發(fā)現(xiàn)病理異常，表明ZnPBA NCs在體內(nèi)具有很高的生物相容性。從標準血液學(xué)分析中可以發(fā)現(xiàn)，除了單核細胞的變化可能與個體差異有關(guān)外，大多數(shù)血常規(guī)檢查指標在組間沒有明顯變化。

關(guān)于肝臟和腎臟功能的血液生化分析（堿性磷酸酶、尿素、肌酐、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶），實驗組（PBS、ZnPBA NCs-iv和ZnPBA NCs-it）的這些數(shù)值沒有病理分布。此外，我們還測定了溶血指數(shù)，以估計ZnPBA NCs是否會破壞血細胞。5μg/ml ZnPBA NCs幾乎不能誘導(dǎo)Balb/c小鼠血細胞的溶血效應(yīng)。這些評估結(jié)果表明，ZnPBA NCs在靜脈注射和氣管內(nèi)給藥兩種方式下都具有顯著的體內(nèi)生物相容性。

隨后，我們利用體內(nèi)熒光成像技術(shù)進一步研究了ZnPBA NCs的生物分布和排泄途徑。我們在ZnPBA NCs表面摻入Cy7染料（ZnPBA-Cy7），然后將其氣管內(nèi)灌入Balb/c小鼠體內(nèi)。如體內(nèi)熒光圖像所示，在用ZnPBA-Cy7處理的小鼠肺部觀察到強烈而持久的Cy7熒光分布。在肺部區(qū)域，ZnPBA-Cy7的熒光強度曲線在8小時內(nèi)僅出現(xiàn)輕微衰減，具有持續(xù)的治療效果。在ZnPBA NCs的排泄方面，肝臟和腎臟的熒光變化表明，早期從肝臟排出的ZnPBA NCs比例較小，而腎臟在8小時內(nèi)排出了大量ZnPBA NCs。