摘要：

細菌性肺炎已被證實會導致急性和嚴重的病理性肺損傷，以及無法控制的氧化細胞因子風暴。針對細菌性肺炎的有效療法要求高效清除病原體、緩解氧化應激和抗炎。然而，目前的療法無法通過一種性能令人滿意的單一藥物來實現這些目標。在此，我們報告了一種自組裝的普魯士藍類似物六氰基鐵酸鋅納米催化劑（ZnPBA NCs），它具有出色的廣譜抗菌活性，并對多種活性氧（ROS）和相關的細胞因子風暴具有抗氧化催化活性。通過使用各種氧化物質和體內小鼠細菌性肺炎模型，我們驗證了合成的六氰合鐵酸鋅納米催化劑可以同時消除細菌感染，并在很大程度上緩解感染引起的氧化應激和炎癥，這表明它在防治多種細菌感染相關疾病方面具有廣闊的臨床應用前景。

引言：

炎癥是先天性免疫系統面對病理刺激（如病原體、異常細胞和細菌/病毒）挑戰時最普遍的一種反應，目的是清除有害物質以保護宿主。先天性免疫系統被激活后，免疫細胞分泌的細胞因子可特異性地增強病變部位血管系統的通透性，使白細胞（主要是巨噬細胞）穿越并聚集在目標部位。活化的巨噬細胞可通過吞噬和呼吸爆發清除外源性病原體和異常體細胞，引發炎癥級聯反應。當病理刺激恢復到生理水平時，巨噬細胞將失去活性，炎癥消退。然而，如果病原體或其他病理刺激持續存在，炎癥就會繼續，導致免疫疲勞。例如，長期慢性炎癥會使巨噬細胞鈍化，在先天性免疫無法清除的殘余病原體感染下，導致持續的炎癥癥狀。在某些極端情況下，病原體入侵的惡化無法控制，會引發突出甚至致命的炎癥，導致大量氧化呼吸爆發和細胞因子風暴，不可避免地對鄰近組織造成副作用。細菌性肺炎是最危險的炎癥類型之一，每年影響4.5億人，造成約400萬人死亡。要有效治療細菌性肺炎，就需要清除病原體、抑制細胞因子風暴以及減少氧化物種等綜合療法。臨床上，抗生素（如青霉素、氨芐西林和頭孢菌素等）是治療肺炎的首選藥物，可殺死病原菌。然而,目前普遍存在的濫用抗生素的現象可能會導致產生抗菌素耐藥性的風險，以及惡心、腹瀉、頭暈或頭痛等副作用。此外，N-乙酰半胱氨酸和乙酰-L-肉堿等廣譜抗氧化劑也被用于肺炎的治療，但這些抗氧化劑的生物利用度差、效率低。此外，目前大多數治療方法都側重于抗生素或炎癥抑制，導致炎癥癥狀緩解緩慢或/和持續感染。因此，最有吸引力的藥物應具有更高的生物利用度，更重要的是，同時具備抗細菌感染和抗氧化炎癥的雙重功能，以有效治療肺炎，但這仍然是一個巨大的挑戰。

具有多種催化性能和功能的納米材料為解決細菌耐藥性、清除ROS以及免疫調節等各種治療難題提供了多種解決方案。例如，過渡金屬基納米催化劑、金屬（Zn、Cu、Ce等）氧化物、多酚納米顆粒已被廣泛用于治療炎癥、細菌感染和氧化應激相關疾病。普魯士藍納米粒子（PBNPs）是經美國FDA批準的重金屬解毒劑，具有很高的生物相容性，在治療老年癡呆癥、動脈粥樣硬化、胰腺炎等疾病方面被廣泛研究。Zhang等人合成了多孔錳取代普魯士藍類似物（PBA），這是一類由其他金屬取代原鐵的普魯士藍類材料，包覆辛伐他汀后可清除ROS并緩解炎癥，用于動脈粥樣硬化治療。在針對細菌性肺炎的治療過程中，細胞因子風暴以及由此產生的氧化應激應得到特別的抑制，與此同時，我們認為細菌病原體的清除也同樣重要。因此，基于PBA的新型納米藥物既能很好地抗氧化/抗炎，又能抗細菌感染，是非常理想的。

在本研究中，我們報告了一種雙功能摻鋅普魯士藍類似物納米催化劑（ZnPBA NCs），通過同時抗菌和抗氧化/炎癥，實現高效的細菌性肺炎治療（圖1）。研究人員詳細考察了ZnPBA NCs的殺菌和抗氧化多酶類納米催化性能。由于ZnPBA NCs具有良好的抗菌和抗炎特性，人工合成的ZnPBA NCs對細菌性肺炎具有廣闊的治療前景，并具有進一步的生物醫學應用潛力，可用于治療與炎癥和氧化應激有關的疾病。

材料與方法：

材料：

氯化鋅（ZnCl2）、鐵氰化鉀（K3[Fe(CN)6]）、3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺二鹽酸鹽（TMB-HCl）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。鹽酸（HCl，36.0%-38.0%）、過氧化氫（H2O2，30%）和叔丁基過氧化氫（tBHP）、脂多糖。磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4，0.01M）、漢克平衡鹽溶液（HBSS，pH7.4，0.01M）、杜氏改良鷹培養基（DMEM，高糖）和青霉素-鏈霉素（10,000U/ml），胎牛血清（FBS）。所有化學品和試劑均為分析級，使用時無需進一步純化。

表征：

用配備了EDS的Hitachi-HF5000拍攝了TEM圖像。將樣品分散在水中，然后滴在銅柵格上進行干燥。在Malvern Zetasizer Nanoseries上用DLS檢測樣品的Zeta電位和水動力粒度分布。ZnPBA NCs的晶體結構由X射線衍射儀在40kV和40mA下用CuKα輻射分析，掃描速率為每步2秒，步長為0.02。ZnPBA NCs的拉曼光譜在LabRAM HR Evolution上記錄，激光波長為1500至3400cm。樣品通過冷凍干燥法制備。傅立葉紅外光譜儀NicoletiS10光譜儀使用KBr小球對ZnPBA NCs進行表征。X射線光電子能譜儀在ESCAlab250上運行。樣品在2kV1μA下進行了表面蝕刻預處理。數據由CasaXPS軟件進行分析。

ZnPBA NCs的合成：

將0.5mmolK3[Fe(CN)6]溶于50mlHCl（溶液A）。0.75mmolZnCl2和200mgPVP溶于50mlHCl（溶液B）。然后，在攪拌下以120毫升/小時的速度將溶液A注入溶液B。首先進行純化以去除未反應的物質。使用超濾管進一步濃縮所得溶液。鉀、鐵和鋅的濃度通過ICP-OES進行定量。

ROS清除活性：

采用TMB發色法評估ZnPBA NCs的-OH清除活性。將250μMTMB、1mMFeSO4和ZnPBA NCs（1、2、5、10、20、40、80和160μg/ml）加入HAc/NaAc緩沖溶液（0.05M，pH=4.5）中。然后在上述溶液中加入2mMH2O2，在黑暗中孵育5分鐘。用微孔板閱讀器檢測光吸收。

ZnPBA NCs的超氧陰離子清除活性采用WST-8總超氧化物歧化酶檢測試劑盒進行檢測。根據生產商的說明，在工作液中分別加入0、0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50和100μg/ml的ZnPBA NCs。孵育30分鐘（37?C）后測量光吸收。根據試劑盒提供的公式計算ZnPBA NCs的抑制率。

ZnPBA NCs的EPR光譜在BrukerE500上進行。選擇5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）作為捕氮劑，以捕獲羥自由基和超氧陰離子。在檢測羥自由基時，在PBS緩沖液中加入2.5mMH2O2、20μMFeSO4、100mMDMPO和100μg/mlZnPBA NCs。檢測超氧陰離子時，在PBS緩沖液（0.1M，pH=7.4）中加入0.1單位/毫升黃嘌呤氧化酶、1mM黃嘌呤、100mMDMPO和100μg/mlZnPBA NCs。然后將等量溶液轉移到石英管中進行EPR測量。

ZnPBA NCs的H2O2清除活性是通過Unisense氧微電極檢測溶解氧來實現的。具體來說，將氧微電極插入含有10mMH2O2和0、25、50和100μg/ml ZnPBA NCs的溶液中。在15分鐘內記錄校準溶解氧濃度。

通過使用氧微電極（Unisense）測量溶解氧來測定ZnPBA NCs的催化穩定性。溶液的溫度（20、25、30、35、40、45和50?C）由水浴控制，溶液的pH值（4.0、5.5、6.5、7.4、8.0和10）由不同pH值的檸檬酸鈉-鹽酸緩沖體系調節。將氧微電極垂直插入含有5mMH2O2或5mMH2O2+10μg/mlZnPBA NCs的緩沖溶液中。在5分鐘內記錄校準溶解氧濃度。

細胞培養：

小鼠白血病單核/巨噬細胞系和人肺成纖維細胞醫學研究理事會細胞株5（MRC-5）購自中國科學院類型培養物保藏委員會細胞庫。RAW264.7和MRC-5細胞在含有10%FBS和100U/ml青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養基中培養，培養箱溫度為37?C，5%CO2加濕。

ZnPBA NCs的體外生物相容性評估：

細胞計數試劑盒-8用于ZnPBA NCs的體外生物相容性檢測。具體方法是將RAW264.7細胞以每孔1×104的密度接種到96孔板中，培養12小時后棄去培養基，用PBS沖洗細胞兩次。隨后，將含有不同濃度ZnPBA NCs（0、3.125、6.5、12.5、25、50和100μg/ml）的新鮮DMEM高葡萄糖培養基接種到孔中。在孵育12小時、24小時和48小時后，用PBS沖洗細胞兩次，然后加入100μl新鮮DMEM高糖培養基（10%CCK-8溶液，不含FBS），孵育1小時。細胞活力（對照組的百分比）按以下公式計算。

其中，Asample是有ZnPBA NCs共孵育孔的吸光度，Acontrol是沒有ZnPBA NCs共孵育孔的吸光度，Ablank是沒有細胞的孔的吸光度。