材料與方法

細胞培養和處理

小鼠系膜細胞（購自上海中國科學院）根據制造商的說明，在補充有10%胎牛血清的低糖DMEM培養基中，于37°C，CO?培養箱中培養。將密度為1 x 10?/mL的細胞接種在6孔板中，使其達到80-90%匯合度。使用含0.03%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細胞。正常葡萄糖組用5.5mM葡萄糖處理，而高葡萄糖組分別用25 mM、30 mM、35 mM和40 mM葡萄糖處理。過夜饑餓后，細胞與正常或高葡萄糖一起孵育24小時。NaHS（Sigma）在加入葡萄糖的同時加入系膜細胞，濃度分別為5μM、10μM、30μM、50μM和100μM。系膜細胞的增殖通過MTT（3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴化物，Sigma Aldrich）法檢測，如前所述。

RNA干擾和PI3K抑制

針對TLR4的小干擾RNA購自Santa Cruz（sc-40261）。使用siPORT NeoFx轉染試劑（Ambion）將siRNA轉染至小鼠系膜細胞，根據制造商的說明進行操作。LY294002，（2-(4-嗎啉基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮）被用作磷脂酰肌醇3-激酶的特異性抑制劑。

實時H2S生成測定

H?S生成的實時測定如前所述。簡言之，將細胞收集在含有蛋白酶抑制劑（2 mM苯甲基磺酰氟，1 mM原釩酸鈉和10 mg/ml抑肽酶）的PBS中，并在冰上勻漿15秒。然后將懸液在5000 rpm離心5分鐘，之后將上清液置于溫度控制的微呼吸室（Unisense）中，使用微型H?S微呼吸傳感器（Model H2S-MRCh;Unisense）和Unisense PA2000放大器測量H?S生成。H?S生成通過改良的Bradford法測定總蛋白濃度進行標準化。

蛋白質印跡分析

蛋白質印跡分析如前所述進行。小鼠系膜細胞用冰冷的RIPA裂解緩沖液（P0013C,Beyotime）進行勻漿和裂解。每孔上樣30μg蛋白質于10%SDS-PAGE凝膠中，然后轉移到硝酸纖維素膜上。用溶解在PBS中的5%脫脂奶粉封閉后，將膜與一抗在4°C下以1:1000稀釋度孵育過夜。實驗中使用的抗體有：TLR4(25)(Santa Cruz,sc-293072),CSE(CTH P-15)(Santa Cruz,sc-131905),磷酸化-Akt(Ser473,Santa Cruz,sc-293125),Akt(Santa Cruz,sc-5298),磷酸化-PI3K(Santa Cruz,sc-130211)和PI 3-激酶C2α抗體(H-300,Santa Cruz,sc-67306)。將辣根過氧化物酶偶聯的二抗應用于膜上，在室溫下孵育1小時。使用增強化學發光蛋白質印跡檢測系統（Santa Cruz）可視化免疫反應蛋白。采用GeneGnome HR掃描儀通過GeneTools軟件對膜的印跡進行定量。測定肌動蛋白（Actin）表達以量化相對蛋白表達水平。

統計分析

數據以均數±標準誤（mean±SEM）表示。僅兩組間比較時采用雙尾Student's t檢驗，多于兩組間比較時采用單因素方差分析（one-way ANOVA），隨后進行Student-Newman-Keuls事后檢驗。使用SPSS 16.0（SPSS,Inc.），小于0.05的P值被認為具有統計學意義。

結果

高葡萄糖抑制內源性H2S合成并誘導小鼠系膜細胞過度增殖

首先，我們研究了葡萄糖對在5mM（對照）、20 mM、25 mM和30 mM葡萄糖中培養的小鼠系膜細胞活力的影響。結果發現，高葡萄糖孵育導致小鼠腎系膜細胞顯著過度增殖，呈濃度依賴性（圖1A）。25 mM葡萄糖誘導了細胞活力的高度增加。然后評估了在高葡萄糖培養的小鼠系膜細胞中的內源性H?S合成。蛋白質印跡分析檢測到，與對照組相比，20 mM、25 mM和30 mM葡萄糖組中CSE表達顯著降低（圖1C）。此外，與對照組相比，在25 mM和30 mM葡萄糖中孵育的細胞的H?S生成速率顯著降低（圖1B）。最后，通過施用NaHS進行H?S補充。結果發現，NaHS處理顯著抑制了系膜細胞的過度增殖。

圖1. 高葡萄糖（HG）誘導小鼠系膜細胞顯著過度增殖，這可能部分歸因于內源性H?S合成缺陷或TLR4激活。（A）HG誘導小鼠系膜細胞顯著過度增殖。25 mM甘露醇處理未顯著改變小鼠系膜細胞活力（數值為均值±標準誤；P < 0.05，P < 0.01 vs. 5mM葡萄糖；##P < 0.01 vs. 25 mM葡萄糖；n = 4）。（B）與5 mM葡萄糖相比，25 mM和30 mM HG處理顯著降低H?S生成速率（數值為均值±標準誤；P < 0.05，P < 0.01 vs. 5 mM葡萄糖；n = 4）。（C）HG處理以濃度非依賴性方式顯著降低CSE表達（數值為均值±標準誤；P < 0.05，P < 0.01 vs. 5 mM葡萄糖；n = 4）。（D）25mM和30mM HG處理顯著增加TLR4表達（數值為均值±標準誤；P < 0.05，**P < 0.01 vs. 5 mM葡萄糖；n = 4）。