超極化實驗：

使用SPINLAB極化器進行超極化實驗。將100μ[1-13C]（含有15mM的三苯甲基自由基）放入偏振器中。溶液在193.93GHz頻率下被極化三次（2小時）。將超極化樣品溶解在17.5毫升溶解緩沖液（100毫克/升EDTA）中，并在1.46毫升中和緩沖液（0.4M TRIS，100毫克/升EDTA，0.72M NaOH）中和，得到生理pH值為61.4-68.4毫摩爾的等滲[1-13C]丙酮酸。溶解后的樣品溫度為30-35°C。在4.5毫升呼吸培養基中稀釋0.5毫升[1-13C]丙酮酸，最終濃度約為6毫摩爾[1-13C]丙酮酸。超極化實驗在臺式1T NMR系統中進行，以10°翻轉角和2秒重復時間進行180次采集。使用iNMR軟件對數據進行了比率分析，與之前報道的方法相同。

LDH活性測定：

LDH活性測定按照生產商的說明進行，僅做少量改動。在室溫（RT）下用哺乳動物蛋白提取試劑m-per裂解1×106個細胞，并補充蛋白酶抑制劑醇15分鐘，然后離心并收集上清液。在PHERAstar FS微孔板閱讀器中對384孔板進行分析。在吸光度光譜的最高峰（462nm）處讀取吸光度，并根據LDH樣品溶液中的蛋白質量對活性測量值進行歸一化處理。蛋白質定量使用Qubit3.0Flourometer進行測量。

NAD+/NADH定量：

利用酶循環反應測定法對細胞內核苷酸、NAD和NADH及其比率進行定量。用哺乳動物蛋白提取試劑mper和蛋白酶抑制劑醇和NADH的定量根據生產商的說明分析在PHERAstar FS微孔板閱讀器的384孔板中進行。

RNA純化和定量PCR：

將1×106個細胞/毫升接種到6孔板中，在37°C、濕度為5%CO2的培養箱中培養過夜。處理后，使用TRIZOL提取RNA。使用Qubit3.0Flourometer確認RNA的濃度和純度。CDNA合成使用Revert Aid First strand cDNA合成試劑盒。根據制造商的說明使用SYBR Green qPCR Master Mix進行QPCR。簡言之，以100ngcDNA為模板進行PCR擴增，通過熔解曲線分析確認產物的特異性。實時qPCR在Agilent Ariamx實時系統上進行。表1列出了用于qPCR的引物。

統計分析：

所有數據均以平均值±SEM表示。所有統計分析均在GraphPad Prism5中進行。數據分析采用非配對學生t檢驗和雙向或三向重復測量方差分析。當數據不呈正態分布時，執行對數變換。P<0.05（*）的值被認為具有統計學意義。

結果：

1.草氨酸對正常和高血糖NRK-52E培養細胞活力、增殖和表型的影響

圖1：草氨酸對正常和高血糖細胞培養物中細胞活力、增殖、表型和乳酸生成的影響。A)在高血糖培養條件下（p=0.8933）以及草氨酸處理后（p=0.0002），細胞活力下降。B)細胞增殖在高血糖條件下增強（p=0.8429），但在草氨酸處理后受到抑制（p<0.0001）。C)四種細胞培養物的代表性圖像顯示草氨酸處理后表型的變化。D)在正常和高血糖條件下，NRK-52E細胞培養物中13C乳酸-Σ信號的變化與草氨酸處理有關。高血糖細胞培養條件增加了信號（p=0.0005），而草酸鹽處理降低了信號（p=0.0366）。

為了確定高血糖時抑制近端腎小管細胞（PTC）LDH的效果，我們在正常培養條件和高血糖培養條件下培養了NRK-52E細胞。兩種培養條件均使用LDH抑制劑草氨酸進行處理。我們檢測了細胞的存活率和增殖率，發現當培養細胞暴露在高血糖條件下時，存活率略有下降，增殖率微弱上升（圖1A和B）。然而，在正常和高血糖的NRK-52E細胞培養物中加入草氨酸會顯著降低細胞活力，分別從90.76%和88.86%降至79.10%和81.64%（p=0.0002），增殖也分別從3.5×106和3.94×106降至2.43×106和2.17×106（p<0.0001）。草氨酸處理對細胞形態也有深遠影響，因為處理后細胞體積增大（圖1C）。單獨暴露于高血糖條件下的細胞的細胞質和細胞核形態似乎與對照細胞相似。單獨暴露于草氨酸會導致細胞體積增大，細胞質出現中度空泡化。高血糖條件和草酸鹽處理相結合，細胞體積和胞質空泡化程度略有增加。

2.草氨酸對正常和高血糖NRK-52E培養細胞中LDH、乳酸生成和NAD+/NADH比率的影響

圖2：LDH活性和NAD+/NADH總定量。在高血糖條件下培養的NRK-52E細胞中，無論是否經草銨膦處理，LDH的檢測值都較高（p=0.2551）。高血糖條件下（p=0.3181）和草銨膦處理后（p=0.0568），NAD+/NADH比值均下降。

使用超極化[1-13C]丙酮酸，發現在葡萄糖上培養24小時的NRK-52E細胞的乳酸信號比正常對照細胞增加了3倍（p=0.0005）（圖1D）。用草酸鹽處理正常和高血糖細胞培養物表明，用草酸鹽處理減少了兩組細胞中丙酮酸到乳酸的產生（p=0.037）（圖1D）。與正常細胞相比，高血糖條件下NRK-52E細胞的LDH活性在數值上更高，盡管沒有達到統計學意義（p=0.0572），同樣，草氨酸處理后LDH活性在數值上更低（p=0.098）（圖2A）。正常細胞和高血糖細胞的NAD+/NADH比值基本相似（p=0.3181），而在草氨酸處理后觀察到NAD+/NADH比值降低（p=0.0568）（圖2B）。