摘要:

糖尿病腎病（DKD）與代謝模式的改變有關，即使在氧氣供應充足的情況下，也會導致乳酸生成增加。研究表明，高血糖是決定DKD發展的一個重要因素。在此，我們探討了在高血糖條件下，乳酸脫氫酶（LDH）抑制劑草酸鹽對離體大鼠腎近曲小管細胞（NRK-52E）產生的代謝影響。在1T NMR系統中，用超極化[1-13C]丙酮酸在高D-葡萄糖（25mM）負荷下或不在高D-葡萄糖（25mM）負荷下對草氨酸（100mM）處理24小時的細胞進行了研究。使用氧氣微電極系統進行了呼吸測量。在存在或不存在高D-葡萄糖的情況下，對細胞進行草氨酸處理可分別減少乳酸產生/積累36.5%或22.5%。研究發現，NRK-52E細胞的增殖減少、肥大效應以及血管內皮生長因子（VEGF）表達升高。在用草氨酸處理高D-葡萄糖培養的NRK-52E細胞時，糖酵解通量的增加導致細胞耗氧率的上調。我們的研究結果表明，暴露于高血糖條件下的體外培養NRK-52E細胞可通過抑制LDH使糖酵解通量轉向氧化磷酸化。有氧代謝和無氧代謝之間的這種聯系可能取決于氧化還原平衡（NAD+/NADH比率）。總之，高血糖條件和草酸鹽處理會改變NRK-52E細胞的代謝表型，使其在NAD+/NADH比值降低的介導下增加氧的利用，進而降低細胞的增殖/存活率。

引言：

糖尿病（DM）是慢性腎病（CKD）和終末期腎病（ERSD）的主要病因。越來越多的證據表明，腎小管間質空間的變化是導致DKD的主要決定因素。近端腎小管占外腎皮質的90%，約占整個腎臟質量的50%。在DKD的發展過程中，腎臟在葡萄糖穩態中的關鍵作用非常重要，其中包括葡萄糖生成、葡萄糖濾過、葡萄糖重吸收和葡萄糖消耗過程。眾所周知，糖酵解和氧化磷酸化等ATP生成途徑在細胞生命周期中舉足輕重，因此也是包括DKD在內的腎臟疾病進展的關鍵組成部分。有趣的是，新的報告顯示，激活丙酮酸激酶M2（PKM2）可增加糖酵解通量，從而在糖尿病嚙齒動物模型中產生腎保護作用。然而，人們對與高血糖相關的糖酵解適應性及其對糖尿病腎臟病理生理學中細胞模式改變的貢獻仍然知之甚少。高血糖的后果不僅會改變糖酵解通量，還會改變耗氧量，從而導致缺氧。缺氧是DKD發生和發展的早期事件，而占腎耗氧量80%的近端腎小管尤其容易缺氧。

缺氧不可避免地會增加乳酸的產生，但卻犧牲了對能量更有利的氧化磷酸化。另一方面，已證明高血糖會誘發一種變異的缺氧，即假性缺氧。高血糖會導致多元醇通路通量增加；高級糖化終產物（AGE）形成增加；蛋白激酶C（PKC）同工酶活化；和己二胺通路通量增加--最終導致NADH/NAD+比率升高和乳酸鹽產生。在此，我們推測，如果LDH表達或乳酸鹽生成的增加在高葡萄糖誘導的近端小管細胞代謝重編程中起著關鍵作用。那么是否有可能使用LDH抑制劑草氨酸直接靶向LDH酶？

草氨酸是丙酮酸的同種異構電子類似物，也是一種著名的LDH抑制劑。由于草氨酸在腫瘤細胞的沃伯格效應中起到阻礙LDH-M的作用，長期以來一直備受研究關注，最近又被證實能改善糖尿病小鼠的胰島素敏感性。1H和/或13C NMR光譜法可量化穩態代謝物濃度，但受靈敏度限制，掃描實驗時間較長，且難以轉化為體內條件。超極化13C NMR是一種補充技術，能以足夠的靈敏度評估代謝通量，甚至能繪制體內快速代謝過程圖，從而將該方法直接應用于體內情況。為了研究草酸鹽補充劑對高血糖和LDH抑制的影響，我們在此使用了超極化[1-13C]丙酮酸NMR光譜和呼吸測定法。

材料與方法：

細胞培養：

NRK-52E細胞是一種大鼠腎上皮細胞系，NRK-52E細胞在含低糖的Dulbeccos改良老鷹培養基，該培養基補充有10%的胎牛血清、10單位/毫升青霉素和10毫克/毫升鏈霉素。細胞數量和活力通過胰藍排除試驗測定。每隔兩天或三天更換一次生長培養基，并對細胞進行亞培養，直到菌落匯合度達到80%時再做進一步測定。在所有細胞實驗中，共準備了四組細胞，一組未經處理，一組用25mM D-葡萄糖處理24小時，一組用100mM草氨酸處理24小時，一組用25mM D-葡萄糖和-100mM草氨酸處理24小時。

呼吸測定法：

37°C下，在帶有O2電極的封閉式Unisense微呼吸室（UnisenseA/S，丹麥奧胡斯）中測量耗氧量。每次實驗使用1000萬個懸浮的NRK-52E細胞。在進行微呼吸測量前，用鑷子夾取NRK-52E細胞并在DMEM緩沖液中重懸。測量開始前，將細胞轉移到密閉室并讓其穩定5分鐘。在5μM Oligomycin的存在下抑制ATP合酶。最大呼吸能力是在解偶聯劑間氯苯基甲酰氰腙（CCCP）滴定步驟的存在下測量的。加入羅替酮（1μM）和抗霉素A（5μM）以完全關閉氧化磷酸化。由此產生的呼吸作用來自非半胱氨酸氧消耗過程。