3結果與討論

3.1 Geobacter生物膜生長

圖1顯示了在恒定電位下（與Ag/AgCl相比為0.1 V）基于碳布的Geobacter生物膜隨時間的電流產生變化。紅色箭頭表示測量生物膜生長期間進行pH和CV測量的電流。從這張圖中可以看出，電流密度在45小時接種后達到了1.07A m-2，如第一個紅色箭頭所示。隨著細菌或生物膜的附著增加，電流密度呈上升趨勢，直至256小時接種后達到5.89A m-2。此后，隨著時間的推移，Geobacter生物膜的電力產生能力進一步提高。值得指出的是，在440小時生長后，最大電流密度驚人增長至10.71 A m-2。之后呈穩定下降趨勢。然后在462小時時更換了新的陽極液并再次循環?？梢钥吹?，電流重新開始并在10.70A m-2達到最大值，幾乎與之前的最大電流密度相等，這意味著長時間運行時，深層生物膜生長受到底物短缺或質子積累（低pH）的限制，這些對生物膜活性具有抑制作用。在576小時運行后，提取了呼吸陽極生物膜進行生物多樣性分析。16S rRNA分析結果顯示，Geobacter spp占74%，如圖S3(a)所示。還進行了重復實驗，結果清楚地顯示，與此處的生物陽極得到了類似的電流密度，如圖S1(c)所示。生物多樣性分析表明，Geobacter spp在圖S3(b)中占65%。

圖1.在恒定施加電位（-0.1 V vs.Ag/AgCl）下的Geobacter生物膜生長情況。紅色箭頭表示用于pH和CV測量的各種電流密度（它們分別為1.07A m 2，1.27A m 2，2.58 A m 2，2.97A m 2，4.46 A m 2，5.89 A m 2，7.93 A m 2，9.25 A m 2，9.83 A m 2，10.71A m 2，10.23 A m 2和10.70A m 2，分別為45小時，72小時，116小時，140小時，205小時，256小時，285小時，330小時，418小時，440小時，455小時和482小時）。

3.2 Geobacter生物膜內原位pH分布

為了量化Geobacter生物膜深度方向上的實時pH分布，使用pH微電極獲得了pH-深度剖面。它們在不同的電流水平下進行了測量，如圖1中所示的紅色箭頭。pH微電極尖端首先放入批量溶液中，距離生物膜表面數千微米，然后逐步向下移動。考慮到生物膜表面的不規則性，每個電流密度選取了至少3個位置進行pH測量，測得的數據見圖S4。每個電流密度的平均pH-深度剖面計算并繪制如圖2(a)–(e)所示。發現在每個pH-深度剖面中都存在一個靠近0mm處的小區域（圖2中），在該區域中，測得的pH值變化很小或幾乎保持不變。這表明微電極尖端已經進入到電極表面的附近。因此，可以假設這個小區域位于生物膜底部附近，即電極表面。在圖2中，生物膜底部（電極表面）位于深度為0mm處。預期，隨著微電極尖端從溶液（3500mm）向陽極表面（0mm）移動，pH逐漸降低，無論生物膜的年齡如何，都會發生這種情況。圖2(f)展示了在7.93 A m-2下測得的一個pH-深度剖面及其相應的質子濃度深度（PCdepth）剖面?？梢郧宄乜吹?，pH曲線呈S形，PC曲線呈鋸齒狀。實際上，在所有實驗中，“S”和“Z”形狀的曲線始終存在。仔細觀察圖2(a)–(e)，可以看到沿深度方向的pH分布可以分為三個典型區域，即陽極生物膜、濃度邊界層和批量溶液。由于它們具有不同的主要功能，這三個區域顯示出不同的特性。眾所周知，由于在批量溶液中沒有微生物營養物去除和緩沖溶液的影響，在該區域中pH預計應保持在一個常數附近，這與生物系統中底物和/或氧分布的趨勢相似。在圖2中，一個陡峭的斜坡總是出現在750和1300mm之間的所有剖面中，實際上是位于邊界層和批量溶液之間的界面，這種急劇下降也表明pH微電極尖端從批量溶液中穿過界面層，然后穿過界面層以及之后的電力生產生物膜。

圖2.在電流密度為1.07A m-2和1.27A m 2時Geobacter生物膜內的平均pH分布，邊界層和批量溶液（a）；在2.58 A m 2和2.97 A m 2時（b）；在4.46 A m 2，5.89 A m 2和7.93A m 2時（c）；在9.25 A m 2和9.83 A m 2時（d）；在10.71A m 2，10.23 A m 2和10.70A m 2時。誤差線表示標準偏差。圖2(f)是在7.93A m 2下測量的剖面之一，以及Geobacter生物膜內上方和內部的質子濃度剖面。

3.3 Geobacter生物膜的厚度

在生物電化學系統中，證明了質子主要通過對緩沖系統的共軛堿（即，HPO2 4tHt!H2P4）質子化而從陽極生物膜中轉運出來。使用pH微電極獲得的pH數據實際上只反映了未絡合的質子（自由質子）的濃度。Marcus等人開發了一個描述陽極生物膜建模的平臺，描述了電中性、ARB半反應、擴散、遷移和酸堿化學的同時發生的現象。他們的結果顯示，pH發展與邊界層內的深度之間具有近似線性關系，并且在生物膜內具有指數關系，這與我們在圖2中的實驗結果非常一致。我們知道，當pH微電極開始從濃度邊界層穿過生物膜時，pH值應該有最大的下降。因此，通過計算pH到深度的一階導數，可以根據斜率趨勢識別生物膜或界面的位置。通過這種方式，可以估算生物膜的厚度和邊界層的厚度。

以7.93 Am-2的pH-深度剖面為例，選擇了5個位置進行pH測量。它們的一階導數圖在圖3(a)中呈現。將這些圖的平均值作為插圖顯示的平均一階曲線。可以清楚地看到，在批量溶液、邊界層和Geobacter生物膜中，斜率完全不同。在批量溶液中，導數保持在零附近，因為此處的pH值大致是常數，然后導數遠離零，反映出微電極逐步向下移動進入邊界層。在那之后，它逐漸增加到pH/mm的斜率，直到獲得最大斜率?？梢园l現，在邊界層中，導數并不保持不變，這可能是由邊界層中的游離細菌引起的。實際上，最大斜率的位置是陽極生物膜和邊界層的界面。這是因為電流或質子H+實際上是在生物膜內產生的，并且底物在這個界面上接觸到?？梢灶A期，由于H+和底物的擴散效應，離開界面的位置的H+梯度和因此pH值的梯度趨向于減小。在Geobacter生物膜內部，斜率急劇下降，直到達到生物膜底部，因為內部的有效擴散系數減小。正如可以清楚地看到的那樣，插圖中的最大斜率的拐點位于約275mm的深度處，因此是生物膜厚度dbiofilm。代謝不活躍的生物膜層也可以通過在該區域檢測到的pH值與活躍生物膜相比呈相反趨勢來檢測到。如圖2(d)和圖2(e)所示，在陽極表面附近，pH值要么保持在一個較低值的常數，要么隨深度減小而減小。這表明，這里的質子主要是從外部活躍細胞傳輸的。這也解釋了為什么這個區域的導數等于或小于零。

應該強調的是，我們實際上開發了一種方法來使用測得的pH-深度剖面估算生物膜的厚度，該方法從陽極表面延伸到批量溶液。為了更清楚地描述，該方法總結如下：

（1）借助pH微電極，在給定的生物膜生長階段垂直于深度方向的不同位置獲取沿深度方向的pH分布；

（2）使用在給定生物膜生長階段獲得的pH分布，計算pH對深度的一階導數；

（3）從（2）中獲得的一階導數中計算平均一階導數；

（4）將平均一階導數根據深度繪制出來；

（5）定義平均一階導數獲得其最大值的深度為生物膜厚度或生物膜和邊界層的界面。

（6）界面的右側屬于邊界層和批量溶液之間。這個厚度是任意的。在這里，我們將該厚度定義為從其最大值減小到其最大值的1%所需的距離。

（7）生物膜可以進一步分為活躍部分和不活躍部分。不活躍部分的生物膜是靠近陽極的區域，其pH值非常小或呈負值。不活躍部分的厚度可以通過讀取相應的pH-深度分布來確定?；钴S部分的厚度等于生物膜厚度減去不活躍部分的厚度。

使用上述方法，獲得了其他電流密度下的一階導數圖見圖S5(a)-(h)。插圖是每個電流密度的平均一階曲線。圖3(b)總結了包括不活躍部分和活躍部分的Geobacter生物膜厚度。從這張圖中可以看出，生物膜厚度不斷增加。在1.27 A m-2時約為90um，如果電流增加到2.97 A m-2，則為190um。在285小時的首次接種中它大幅增加，這意味著隨著時間的推移，附著的細菌/生物膜增加了。在7.93 A m-2時達到了275um的厚度。之后，活躍生物膜的發展減緩，然后在9.25 A m-2時達到300um，周圍有部分不活躍的生物膜層約為25um。我們發現，活躍生物膜層的厚度后來保持在約275um左右幾乎不變，這表明由于陽極生物膜附近的底物或低pH的可用性，其厚度已經達到了最大值。因此，我們可以說，從陽極生物膜表面到頂部的275um，其產生質子并消耗乙酸的區域是新陳代謝活躍的。檢測到的不活躍生物膜厚度在10.71 A m-2時增加到約50mm，在10.23A m-2時增加到約75mm。這個結果證明了靠近電極的細胞形成了密集的不活躍層，并且可能會限制乙酸或/和pH，因為已經證明與370um Geobacter生物膜內的外部生物膜相比，電極附近的有效擴散系數大大減小。但是，即使存在不活躍區域，生物膜的細胞外電子傳遞也不會受到阻礙，即使生物膜厚度達到數百微米，因為電導率足夠大，可以使細胞在這個區域之間傳輸電子。這解釋了為什么電流密度不會下降，即使存在不活躍區域。在本研究中，邊界層厚度在450-650um范圍內變化。

圖3.在7.93A m-2下pH對深度的一階導數圖，插圖顯示了平均曲線，誤差線表示標準偏差。（a）；各種電流密度下的生物膜厚度及其活性部分和非活性部分（b）。