摘要：本研究通過使用pH微電極，量化了電力生產生物膜及其濃度邊界層內的空間pH分布，以及批量溶液中的pH分布。探討了pH分布與電流密度之間的關系。發現：（1）與批量溶液的pH 6.90相比，Geobacter生物膜內的陽極表面附近的pH水平低至5.57；（2）生物膜內的平均pH水平隨時間減??；（3）生物膜內的pH變化改變了循環伏安法的中點電位，每單位pH下降59.0 mV；（4）對于25 mM磷酸鹽緩沖溶液，陽極表面附近的pH水平低至4.91，而對于100 mM磷酸鹽緩沖溶液，則為5.73。此外，還提出了一種通過繪制pH-深度剖面的導數來估算生物膜厚度的方法。

1引言

電力生產生物膜以一種獨特的方式進行呼吸，利用固體外部材料作為其新陳代謝的終端電子受體，這在生物電化學系統（BESs）中作為催化劑具有興趣，例如微生物燃料電池（MFCs）和微生物電解電池（MECs），以及海水淡化、生物修復和傳感系統[1-4]。陽極呼吸細菌（ARB）利用MFCs、MECs或其他生物電化學系統的陽極進行呼吸，最終將電子從微生物轉移到陽極。陽極生物膜的電流是由氧化反應引起的，其中發生氧化反應，底物如乙酸或其他有機物質被消耗。在這個過程中，質子釋放到陽極液中，電子轉移到陽極[5,6]，如式（1）所示。

（1）

電子轉移必須伴隨質子轉移以保持溶液電中性，這預計會導致生物電流外部和內部產生pH梯度。此外，更高的電流產生可能會導致更大的質子積累，而這反而可能對陽極生物膜的生長和電子產生產生抑制作用[7-9]。眾所周知，pH在確定電力生產生物膜性能方面起著關鍵作用，因此，了解生物膜內的pH分布對于理解BESs中的電子產生和傳輸機制非常重要。

大多數關于pH變化對陽極生物膜影響的研究局限于批量溶液。研究表明，隨著緩沖液濃度的增加，電流密度增加，表明電流密度受生物膜外質子傳輸的限制[5]。Franks等人證明，當將批量pH從6.9改變為6.15時，使用Geobacter sulfurreducens作為陽極生物膜時，電流減少了50%[10]。為了更好地理解質子傳輸機制，還建立了數學模型來預測電化學活性生物膜（EABs）中的質子傳輸。預測了100mm厚陽極生物膜中的pH變化為0.03單位[11]。Marcus等人預測，對于15 A m2，450mm陽極生物膜上的pH變化為1.5單位[7,8]。通過引入pH敏感熒光探針測量了Geobacter生物膜內4個不同深度的pH值。發現陽極表面附近的pH水平為6.1，而外部介質中為7[10]。Babauta等人使用微電極測量了在1.05 mA電流下Geobacter生物膜內的pH從6.8下降到6.5，在1.85 mA電流下從6.9下降到6.3[12]。這些研究證明了電力生產生物膜內pH分布的重要性。因此，目前仍不清楚電流密度和陽極生物膜內pH分布如何相互關聯。細胞產生的質子及其從陽極生物膜中傳輸出來，應導致生物膜內形成質子梯度。跨越生物膜深度的pH梯度的形成會導致內部微生物的性能降低，并影響其生長[13]。因此，理解微尺度生物膜內pH分布的詳細特性及其對電力生產性能的影響對于改善更好性能的陽極至關重要。

本研究的目標是量化電力生產生物膜深度的空間和時間pH分布和變化。還探討了pH分布與電流密度之間的關系。Geobacter spp是電力生產細菌的優秀候選者，因為它可以將乙酸轉化為電子，并且電子轉移被認為是直接的[3,11,12,14]。通過pH微電極獲取了Geobacter生物膜內的pH-深度剖面，這種方法允許在活體生物膜中進行非侵入性、無破壞性、高空間分辨率和實時測量。找到上述條件取決于了解陽極生物膜內微觀尺度條件，這在目前作者所知之前尚未報告過。此外，還建議通過繪制pH-深度剖面的導數來估算生物膜和邊界層的厚度。

2材料和方法

2.1生物反應器

電力生產生物膜在一個三電極生物反應器（300 mL）中生長在工作電極上，在恒定的施加電位下（相對于Ag/AgCl為0.1 V）。碳布（0.36 0.02 mm厚）的投影表面積為2.4cm2（2.0 cm 1.2 cm），過大的Pt網格（2.0 cm 2.0 cm）作為工作和對電極，參考電極為Ag/AgCl（3 M KCl，Leici Instruments，上海，中國）。碳布購自上海賀森電器有限公司，Pt網格購自天津愛達恒升科技有限公司。該反應器的接種物來自一臺連續運行了6個月以上，具有Geobacter富集細菌群落（65%）的乙酸喂養MFC，最初來自北京高碑店污水處理廠。在初次接種時，生長介質流動停止了24小時，以鼓勵細菌附著到工作電極上。此后，含有乙酸的厭氧、氮氣充氣的培養基通過具有5小時水力停留時間的反應器循環。乙酸被用作電子供體，工作電極被用作電子受體。所有實驗均在35 0.5°C的恒溫箱中進行。生長培養基包含CH3COONa（1.64 g L1），NaCl（0.1 g L1），NH4Cl（0.5 g L1），MgSO4 7H2O（0.1 g L1），CaCl2 2H2O（0.02 g L1），每升10 mL Wolfe維生素溶液[12]和50 mM磷酸鹽緩沖液。每次進行pH和CV測量后，將反應器中的培養基倒出，以去除生物反應器內壁上的懸浮細菌堆積物。然后再次循環新鮮的生長培養基。此外，還進行了一組重復實驗。

2.2 pH微電極的校準

使用pH微電極（Unisense，丹麥）對陽極生物膜內的pH分布進行表征。微電極尖端直徑為50微米。在每次測量之前，使用商業緩沖溶液（pH=4.01、6.86和9.18）對pH微電極進行校準。獲得了線性校準曲線，斜率在-58.10至-58.80 mV/pH范圍內。每次測量后也進行了后校準。

2.3 pH微電極測量

在操作條件下進行了pH測量。通過移除生物膜陽極上方的橡膠塞打開孔口，插入微電極及其參比電極。純氮氣持續從孔口進入頂空，以最小化氧氣從開口處進入系統。將pH微電極尖端首先放入距離生物膜表面數千微米的溶液中，然后逐步向下移動（步長為50-200微米在生物膜外部和25微米在生物膜內部），由計算機上的SensorTrace Profiling軟件進行定期控制，并同時記錄pH值。當通過批量溶液、濃度邊界層并最終到達生物膜底部（陽極表面）時進行記錄。