摘要

間歇性缺氧(IH)與阻塞性睡眠呼吸暫停(OSA)對(duì)心血管造成的后果有關(guān)。然而，由于缺乏合適的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，無(wú)法評(píng)估間歇性缺氧對(duì)內(nèi)皮是有害、保護(hù)還是兩者兼有。這項(xiàng)工作的目的是確定IH氧合波動(dòng)的頻率和幅度對(duì)主動(dòng)脈內(nèi)皮傷口愈合的影響。使用一種新型可控系統(tǒng)對(duì)人原代內(nèi)皮細(xì)胞單層進(jìn)行損傷和恒定充氧(1%、4%、13%或20%O2)或不同頻率(0.6、6或60次/小時(shí))和幅度范圍(13-4%O2或20-1%O2)的IH，24小時(shí)后測(cè)量傷口愈合情況。細(xì)胞單層修復(fù)在20%氧氣和13%氧氣條件下相似，但在4%氧氣的持續(xù)低氧條件下顯著增加(約兩倍)。IH的幅度和頻率在很大程度上調(diào)節(jié)了傷口愈合。在最低頻率(0.6次/小時(shí))下，13%-4%O2的循環(huán)可使內(nèi)皮傷口愈合加快102%。然而，與13%-4%的氧氣振蕩相比，20%-1%氧氣振蕩的IH暴露會(huì)降低傷口閉合速度(在6個(gè)周期/小時(shí)和0.6個(gè)周期/小時(shí)時(shí)分別降低74%和44%)。模擬嚴(yán)重OSA的高頻IH模式(60次/小時(shí))并未顯著改變內(nèi)皮傷口的閉合，與氧合周期振幅無(wú)關(guān)。總之，間歇性缺氧IH中低氧循環(huán)的頻率和幅度會(huì)明顯改變傷口愈合反應(yīng)，并成為決定細(xì)胞在OSA中如何反應(yīng)的關(guān)鍵因素。

最新與值得關(guān)注

間歇性缺氧(IH)會(huì)對(duì)阻塞性睡眠呼吸暫停(OSA)患者的心血管造成影響。然而，以往在與OSA相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究中采用的各種頻率和嚴(yán)重程度的IH導(dǎo)致了對(duì)IH影響結(jié)果的爭(zhēng)議。通過采用優(yōu)化的IH實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，我們提供的證據(jù)表明，間歇性缺氧IH的頻率和程度明顯改變了人體主動(dòng)脈內(nèi)皮的傷口愈合，成為決定細(xì)胞在OSA中如何反應(yīng)的關(guān)鍵因素。

引言

阻塞性睡眠呼吸暫停(OSA)是一種非常普遍的呼吸系統(tǒng)疾病，可能會(huì)對(duì)神經(jīng)認(rèn)知、代謝、腫瘤和心血管造成不良后果。間歇性缺氧(IH)是由OSA患者上氣道反復(fù)塌陷和重新開放引起的，是這種夜間呼吸障礙的主要有害挑戰(zhàn)之一，與OSA的許多病癥有關(guān)。然而，IH也被認(rèn)為是通過誘導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞和器官的預(yù)處理而起到潛在保護(hù)作用的因素。事實(shí)上，關(guān)于IH對(duì)心血管的具體影響一直存在著激烈的爭(zhēng)論。雖然IH會(huì)誘導(dǎo)釋放活性氧和炎癥介質(zhì)，從而損害血管內(nèi)皮功能，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化，但I(xiàn)H也可能通過激活以誘發(fā)預(yù)處理為重點(diǎn)的適應(yīng)性反應(yīng)來(lái)發(fā)揮心臟保護(hù)作用和治療作用。因此，關(guān)于持續(xù)氣道正壓療法(或CPAP)對(duì)OSA患者心血管影響的先驗(yàn)結(jié)論相互矛盾，其原因可能在于IH的多態(tài)性，這一話題在過去幾年中引起了廣泛關(guān)注和爭(zhēng)論。盡管人們一直認(rèn)為周期性缺氧的程度和頻率在IH對(duì)心血管系統(tǒng)的保護(hù)或損害作用中起著關(guān)鍵作用，但使天平傾向一方或另一方的IH特征的確切界限尚不清楚。

細(xì)胞培養(yǎng)是研究IH潛在影響的一種有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)方法，因?yàn)榕c動(dòng)物模型不同，細(xì)胞培養(yǎng)可以選擇性地、精確地將細(xì)胞置于所選擇的IH模式下。然而，由于缺乏合適的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，無(wú)法在體外細(xì)胞中應(yīng)用控制良好的IH模式，研究模仿OSA的IH如何調(diào)節(jié)細(xì)胞行為的工作一直受阻。最近，研究IH對(duì)細(xì)胞影響的方法學(xué)難題得到了解決，即在透氣薄膜上培養(yǎng)細(xì)胞，允許氧氣從膜下空間快速擴(kuò)散到細(xì)胞。這種實(shí)驗(yàn)方法可以在振幅和頻率方面對(duì)細(xì)胞應(yīng)用精確控制的IH模式。鑒于我們有興趣研究控制良好的模擬OSA的IH對(duì)細(xì)胞的影響，并且有合適的實(shí)驗(yàn)環(huán)境，本研究的目的是檢驗(yàn)氧分壓變化的頻率和每個(gè)周期中達(dá)到的最大和最小氧值對(duì)細(xì)胞反應(yīng)的特征起重要作用這一假設(shè)。更具體地說(shuō)，我們使用一種模擬內(nèi)皮修復(fù)的經(jīng)典傷口閉合實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估這一假設(shè)，并研究輕度和重度OSA對(duì)應(yīng)的兩種實(shí)際IH頻率(分別為6次和60次呼吸暫停/小時(shí))對(duì)損傷后內(nèi)皮細(xì)胞單層修復(fù)的影響。對(duì)于每種頻率，我們還研究了兩種氧分壓高低范圍的影響：20%-1%的氧氣波動(dòng)(這是基于IH的細(xì)胞研究中使用的原型)和13%-4%的氧氣波動(dòng)(這相當(dāng)于OSA患者主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞所經(jīng)歷的更真實(shí)的氧張力值)。事實(shí)上，在正常通氣和氣體交換條件下，如果沒有發(fā)生呼吸暫停事件，動(dòng)脈血中的氧分壓(PaO2)約為100mmHg(即13%O2)。假設(shè)在嚴(yán)重OSA事件中動(dòng)脈血氧飽和度(SaO2)可達(dá)到約60%的最低點(diǎn)，則相應(yīng)的PaO2將為約30mmHg，相當(dāng)于4%的氧氣。

方法

細(xì)胞培養(yǎng)。從美國(guó)類型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得的人原代主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)常規(guī)生長(zhǎng)在血管細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基補(bǔ)充了內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)試劑盒-VEGF(ATCC)和抗生素/抗真菌溶液，抗生素/抗真菌溶液的最終濃度為10U/ml青霉素、10g/ml鏈霉素和25g/ml兩性霉素B。實(shí)驗(yàn)前，將細(xì)胞培養(yǎng)物保存在T-25組織培養(yǎng)瓶中，置于20%O2，5%CO2和37℃的標(biāo)準(zhǔn)加濕培養(yǎng)箱中。在使用下述體外系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，使用的是混合度為75%的第4和第5代培養(yǎng)物。

IH體外應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)環(huán)境。在體外細(xì)胞暴露于恒定或可變氧氣濃度(IH)的實(shí)驗(yàn)中，采用了一種定制的實(shí)驗(yàn)裝置，該裝置由一個(gè)聚二甲基硅氧烷(PDMS)系統(tǒng)組成，該系統(tǒng)是根據(jù)之前的設(shè)計(jì)改良而成的。設(shè)計(jì)的裝置以直徑20毫米的PDMS孔為基礎(chǔ)，孔內(nèi)有90μm厚的透氣PDMS膜(圖1A)。孔的底部與氣源相連，通過薄膜的直接擴(kuò)散，使恒定的混合氣體或循環(huán)變化的氣體成分循環(huán)到膜頂部培養(yǎng)的細(xì)胞中。PDMS孔是用Autodesk 123D設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)的陰性聚乳酸模具制成的，并用Ultimaker-2 3D打印機(jī)打印出來(lái)。簡(jiǎn)而言之，將PDMS混合物倒入陰模中，然后用真空罐去除氣泡，再將混合物放入65℃的烤箱中烘烤3小時(shí)，使PDMS固化，然后從模具上剝離PDMS，得到復(fù)制品。另一方面，PDMS膜是按照之前描述的方案在硅晶片上制作的。為了獲得90μm厚的膜，將PDMS混合物倒在晶片中心，以1,000rpm的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)1分鐘。

圖1細(xì)胞暴露于恒定或可變氧氣濃度的體外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。A：對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行受控間歇性缺氧(IH)的細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)置示意圖(解釋見正文)。B：以60次/小時(shí)的頻率進(jìn)行不同量級(jí)的IH(20-1%O2(藍(lán)線)和13-4%O2(黑線))時(shí)，在膜頂部(細(xì)胞培養(yǎng)層)測(cè)得的實(shí)際氧氣濃度。C：以60次/小時(shí)(黑線)和6次/小時(shí)(紅線)的頻率施加13-4%O2的IH時(shí)，在膜頂部(細(xì)胞培養(yǎng)層)測(cè)得的實(shí)際氧氣濃度。每個(gè)時(shí)間軸的顏色與相應(yīng)的線相關(guān)聯(lián)。B和C中的信號(hào)在時(shí)間上有所偏移，以便于視覺比較。

為了確認(rèn)氣體刺激在頻率和振幅方面從氣體攪拌器正確傳遞到培養(yǎng)細(xì)胞，所有用于體外實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)系統(tǒng)都在使用前進(jìn)行了校準(zhǔn)。使用氧氣微傳感器(Unisense)測(cè)量膜頂部(細(xì)胞培養(yǎng)層)的氧氣濃度顯示，系統(tǒng)平衡時(shí)間約為7秒，從而驗(yàn)證了應(yīng)用不同IH模式(包括模擬OSA的高頻模式)時(shí)實(shí)驗(yàn)設(shè)置的正確顯示(圖1，B和C)。如圖所示，改變氧氣失飽和的頻率會(huì)改變失飽和和再飽和的持續(xù)時(shí)間。雖然這種IH模型并不能完全模擬OSA患者在不同呼吸暫停指數(shù)下的實(shí)際缺氧/復(fù)氧時(shí)間，但它再現(xiàn)了大多數(shù)IH實(shí)驗(yàn)中的循環(huán)模式。