2.5.hMSCs二維成骨培養(yǎng)

單層hMSCs成骨測(cè)定時(shí)間進(jìn)程見補(bǔ)充圖1A。第2代培養(yǎng)的hMSCs收獲并以5 x 10?cells/cm2的密度接種在12孔板中，使用α-MEM 15%FBS（D-1）。接種后第二天（D0）加入成骨培養(yǎng)基（α-MEM 20%FBS補(bǔ)充100 nM地塞米松、100μM抗壞血酸和10 mMβ-甘油磷酸酯）±GYY刺激（400-800μM）。培養(yǎng)基和刺激每周更換兩次直至培養(yǎng)D21。在D7、D14、D21進(jìn)行阿爾新紅S（AR-S）和Von Kossa（VK）染色（Sigma Aldrich）評(píng)估礦化的存在和程度。AR-S染色如下進(jìn)行：細(xì)胞在10%甲醛（Kaltek,Padova,Italy）磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中固定15分鐘（RT）后，用40 mM AR-S染色20分鐘，用PBS沖洗兩次。VK如下進(jìn)行：細(xì)胞在1%硝酸銀溶液（Carlo Erba,Milan,Italy）中在UV光下孵育30分鐘，用水沖洗，在5%硫代硫酸鈉（Sigma）中孵育5分鐘。兩種程序結(jié)束后，用去離子水沖洗細(xì)胞以去除非特異性染色。使用Nikon Instruments Europe BV（Amstelveen,the Netherlands）拍攝AR-S+和VK+染色照片（100倍放大）。

2.6.灌注生物反應(yīng)器中的hMSCs三維成骨培養(yǎng)

生物反應(yīng)器中hMSCs成骨測(cè)定時(shí)間進(jìn)程見補(bǔ)充圖1B。在U-CUP流動(dòng)灌注生物反應(yīng)器系統(tǒng)（Cellec Biotek,Basel,Switzerland）中進(jìn)行動(dòng)態(tài)培養(yǎng)下的成骨分化。該系統(tǒng)先前已用于通過連續(xù)灌注在3D支架中接種細(xì)胞，保證均勻分布，有利于營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，增強(qiáng)成骨分化和體內(nèi)骨形成。支架用培養(yǎng)基預(yù)處理幾分鐘以提高可操作性，然后置于流動(dòng)灌注生物反應(yīng)器系統(tǒng)內(nèi)。分離并擴(kuò)增至第2代培養(yǎng)后，將1.5 10?hMSCs重懸于α-MEM 20%FBS中并注入生物反應(yīng)器（D-1）。應(yīng)用3ml/min的流速以使細(xì)胞在每支架內(nèi)過夜接種。接種后第二天（D0），加入成骨因子：100 nM地塞米松、100μM抗壞血酸和10 mMβ-甘油磷酸酯（Sigma Aldrich）。因此，在SF_GYY支架中培養(yǎng)的hMSCs在成骨刺激前接受24小時(shí)H?S“預(yù)處理”。隨后的培養(yǎng)天數(shù)，速率降低至0.3 ml/min。D3進(jìn)行半培養(yǎng)基更換，D7進(jìn)行第一次全培養(yǎng)基更換；支架在連續(xù)灌注下維持最多21天，培養(yǎng)基每周更換兩次。在成骨培養(yǎng)D0、D7或D21收獲構(gòu)建體。將支架切成兩半，一半用于生物分子分析，另一半用于染色和免疫組化分析或活死分析。

2.7.細(xì)胞毒性測(cè)定

此實(shí)驗(yàn)在靜態(tài)條件下培養(yǎng)24小時(shí)進(jìn)行，以減少研究所需的生物反應(yīng)器數(shù)量。收集上清液，并測(cè)量細(xì)胞釋放的乳酸脫氫酶（LDH），按照制造商協(xié)議如下進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，將hMSCs以每支架5 x 103細(xì)胞的濃度四重復(fù)接種到96孔板中，使用無酚紅的α-MEM 7.5%FBS培養(yǎng)24小時(shí)。使用分光光度計(jì)（TECAN Infinite®200 PRO;Tecan Italia S.r.l.,Cernusco Sul Naviglio,Italy）在492-620 nm進(jìn)行LDH比色檢測(cè)，細(xì)胞毒性計(jì)算為與陽性對(duì)照（Triton X-100處理的支架；100%細(xì)胞毒性）相比的倍數(shù)增加。

2.8.細(xì)胞活力測(cè)定

使用“哺乳動(dòng)物細(xì)胞活/死活力/細(xì)胞毒性試劑盒”（Molecular Probes-Invitrogen）進(jìn)行活/死分析。支架用D-PBS沖洗兩次，然后加入EthD-1（4μM）/Calcein AM（2μM）混合物，在37°C孵育45分鐘。再?zèng)_洗兩次后，將支架包埋在最佳切割溫度化合物（OCT compound）中，并在低溫恒溫器中切成5μM切片，方向允許在縱切面切割支架并隨后分析所有層。然后，用DAPI復(fù)染，并用抗褪色封片劑（D2522,Sigma Aldrich）封片。使用Eclipse 90i顯微鏡評(píng)估Calcein（FITC）、ethidium homodimer-1（EthD-1;TRITC）和DAPI陽性染色。通過NIS軟件（Nikon Instruments Europe BV,Amstelveen,the Netherlands）捕獲高放大倍數(shù)（200x）圖像并合并。注意，SF纖維在FITC中發(fā)射自發(fā)熒光。

2.9.RNA分析

在支架上用RNA pure溶液（Euroclone,Milan,Italy）裂解細(xì)胞，使用微量研杵（Sigma Aldrich）破碎構(gòu)建體。隨后，使用氯仿-酚-乙醇提取方案分離mRNA，并通過DNase I（DNA-free Kit,Ambion,Austin,TX,USA）處理從基因組DNA純化。通過PCR Array（330231 PAHS-026ZR-24,Qiagen,Milan,Italy）分析一組成骨基因的mRNA表達(dá)，按照制造商說明。首先使用RT2 PCR array First Strand Kit（Qiagen）從0.6μg mRNA合成cDNA；然后在Rotor Gene Thermal Cycler（Corbett Research,Qiagen）上使用100孔轉(zhuǎn)子進(jìn)行擴(kuò)增，循環(huán)和熱條件按制造商建議。CT值低于33的基因視為未表達(dá)。

2.10.組織學(xué)和免疫組化分析

構(gòu)建體在4%多聚甲醛（PFA）溶液中固定2小時(shí)。樣品以與活/死分析相同的方向石蠟包埋，切成5μm切片并mounted在玻璃載玻片上；然后，它們脫蠟并通過分級(jí)乙醇系列洗滌再水化以進(jìn)行分析。支架內(nèi)的細(xì)胞用蘇木精和伊紅（H&E）（Biocare medical,CA,USA;Riedel de Haen,MA,USA）、AR-S和VK染色（Sigma Aldrich）染色。鑒于蘇木精覆蓋細(xì)胞上的AR-S信號(hào)，我們未對(duì)AR-S切片復(fù)染。相反，對(duì)于VK染色，細(xì)胞進(jìn)行了復(fù)染。對(duì)Ki67（Clone MIB-1,M7240,Dako;2.3μg/ml）、堿性磷酸酶（ALP;B4-78,Dshb;0.5μg/ml）、胱硫醚-γ-裂解酶（CSE;H00001491-M01,Abnova;2μg/ml）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGF A,ab1316,Abcam;10μg/ml）進(jìn)行再水化切片上的免疫組化。進(jìn)行了陰性和同型匹配對(duì)照。使用Universal AP Detection kit（Biocare Medical,Concord,CA）揭示陽性；細(xì)胞用蘇木精復(fù)染，經(jīng)自來水激活，最后用甘油凝膠封片。使用Eclipse 90i顯微鏡評(píng)估陽性染色。通過NIS軟件（Nikon Instruments Europe BV,Amstelveen,the Netherlands）捕獲抓圖（100x）和高放大倍數(shù)（200x,400x）圖像，用于宏觀或微觀描述陽性。

2.11.對(duì)不粘附支架的hMSCs的CFU-F進(jìn)行AR-S染色

在生物反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)期間偶然發(fā)現(xiàn)一群不粘附支架的hMSCs（非粘附hMSCs）。收集這些非粘附hMSCs并進(jìn)行分析。簡(jiǎn)言之，當(dāng)我們?cè)谂囵B(yǎng)D3更換培養(yǎng)基時(shí)，將生物反應(yīng)器中的“耗盡”培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到T25培養(yǎng)瓶中。非粘附hMSCs粘附到培養(yǎng)瓶上，并在幾天內(nèi)形成類似于成纖維細(xì)胞集落形成單位（CFU-F）的聚集體。72小時(shí)后，進(jìn)行AR-S如上所述以評(píng)估成骨能力。使用Nikon Instruments Europe BV拍攝照片（100倍放大）。

2.12.統(tǒng)計(jì)分析

使用GraphPad Prism 6（La Jolla,CA）和SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。在LDH數(shù)據(jù)集和壓縮模量數(shù)據(jù)集中進(jìn)行了比較中位數(shù)與假設(shè)值的Wilcoxon檢驗(yàn)。在LDH數(shù)據(jù)集中進(jìn)行了Kruskall-Wallis檢驗(yàn)。使用制造商提供的基于網(wǎng)絡(luò)的RT2 PCR array Data Analysis工具分析所有分析基因的PCR array數(shù)據(jù)，并在補(bǔ)充表1和2中顯示為倍數(shù)變化。對(duì)選定基因組進(jìn)行了配對(duì)樣本的Bootstrap分析：ALP；骨鈣素（BGLAP）；Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX-2）；Distal-Less Homeobox 5（DLX5）；骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（BMP4）；骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1A型（BMPR1A）；骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體2型（BMPR2）；膠原蛋白XV（COLL XV）；整合素亞基Alpha 1（ITGA1）；整合素亞基Alpha 2（ITGA2）；VEGFA；Fms相關(guān)酪氨酸激酶1（FLT1）。