血紅蛋白中結(jié)合O2的酸敏脫氧。在5毫升pH=7.4和pH=6.5的緩沖介質(zhì)中加入MS NPs(0.1M，20微升)20分鐘后，溶液的吸收率在450到650納米之間(對(duì)照，pH=7.4緩沖液；MS NPs，pH=7.4緩沖液+MS NPs；H+，pH=6.5緩沖液；MS NPs+H+，pH=6.5緩沖液+MS NPs)的吸收率。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了三次，并使用了具有代表性的紫外可見(jiàn)吸收光譜。通常情況下，HbO2在542和577納米波長(zhǎng)處有兩個(gè)吸收峰，而脫氧血紅蛋白在555納米波長(zhǎng)處有一個(gè)吸收帶。

細(xì)胞培養(yǎng)。所用細(xì)胞系均來(lái)自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)，并通過(guò)DNA指紋、同工酶檢測(cè)和支原體檢測(cè)對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定。所有這些細(xì)胞系都經(jīng)過(guò)充分?jǐn)U增，以冷凍瓶的形式保存在液氮中，每三個(gè)月從同一批冷凍瓶中回收使用。NRK-52E大鼠腎近曲小管細(xì)胞系、MCF-7人乳腺癌細(xì)胞系和Hela人宮頸癌細(xì)胞系在高糖DMEM(Gibco)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，BRL-3A大鼠肝臟細(xì)胞系和4T1小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞系在RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco)中培養(yǎng)。培養(yǎng)基中含有鏈霉素(100毫克/毫升)、青霉素(100單位/毫升)和10%熱滅活胎牛血清，培養(yǎng)溫度為37℃，濕度為5%CO2。所有細(xì)胞系在培養(yǎng)過(guò)程中均未進(jìn)一步檢測(cè)支原體污染。

用光學(xué)探針評(píng)估細(xì)胞缺氧情況。首先將MCF-7細(xì)胞(1×105個(gè)細(xì)胞，1ml DMEM，pH=7.4)播種在CLSM專用培養(yǎng)盤中，讓其在5%的CO2氣體環(huán)境中于37℃下附著過(guò)夜。然后將細(xì)胞與濃度為10μg/ml的[Ru(dpp)3]Cl2(Sigma-Aldrich)培養(yǎng)12小時(shí)，再用PBS沖洗三次以除去游離的[Ru(dpp)3]Cl2。在不同處理(pH=7.4的培養(yǎng)基、pH=7.4含10mM MS NPs的培養(yǎng)基和pH=6.5含0、2、5和10mM MS NPs的培養(yǎng)基)中加入1毫升新鮮DMEM培養(yǎng)基后，MCF-7細(xì)胞在共聚焦培養(yǎng)皿中于37℃密封培養(yǎng)2小時(shí)。使用Unisense氧微電極測(cè)量培養(yǎng)基中溶解氧的濃度變化。用激光掃描共聚焦顯微鏡(FV1000)檢測(cè)[Ru(dpp)3]2+的熒光(λex=450nm，λem=610nm(ex，激發(fā)；em，發(fā)射)來(lái)評(píng)估細(xì)胞內(nèi)的氧氣水平。每組分別有五個(gè)和兩個(gè)獨(dú)立的培養(yǎng)皿進(jìn)行溶氧水平測(cè)量和熒光成像。

18F-MISOPET/CT評(píng)估MSNP誘導(dǎo)的體外缺氧。最初的[18O]-misonidazole購(gòu)自華誼科技。隨后的[18F]-MISO是在回旋加速器PETtrace(GE)上制備的，即用質(zhì)子輻照1.5毫升銀靶中的[18O]-misonidazole，實(shí)現(xiàn)18O(p,n)18F核反應(yīng)。首先將MCF-7細(xì)胞(1×107cells，10ml DMEM，pH=7.4)接種到培養(yǎng)盤中，在37℃和5%CO2氣體條件下放置過(guò)夜。在與10毫升新鮮DMEM培養(yǎng)基密封共培養(yǎng)后，分別加入不同處理(pH=7.4的培養(yǎng)基、含有10mM MS NPs的pH=7.4的培養(yǎng)基和含有0、2、5mM MS NPs的pH=6.將細(xì)胞在37℃下再培養(yǎng)2小時(shí)后，立即清洗、胰蛋白酶化、收獲細(xì)胞并用1ml PBS重懸于Eppendorf微離心管(1.5ml)中，在10μl生理鹽水中加入10μCi 18F-MISO。進(jìn)一步共孵育15分鐘后，用PBS充分洗滌細(xì)胞，并在2,000rpm轉(zhuǎn)速下離心沉淀5分鐘，然后進(jìn)行PET/CT成像。

體外癌細(xì)胞饑餓。將MCF-7細(xì)胞(每孔100μl DMEM培養(yǎng)液中含1×104個(gè)細(xì)胞)一式六份地接種到96孔微孔板中，并讓其粘附過(guò)夜。pH=6.5的酸化培養(yǎng)基是通過(guò)加入濃度約為12mM的鹽酸獲得的，鹽酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響微乎其微。然后用含有0、2、5和10mM MS NPs的pH=6.5的新鮮培養(yǎng)基取代培養(yǎng)基。在密封培養(yǎng)后的特定時(shí)間間隔內(nèi)，用Unisense氧微電極測(cè)量溶解氧水平，并用典型的MTT法(MTT，3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑)檢測(cè)隨時(shí)間變化的細(xì)胞活力(vt)。細(xì)胞生長(zhǎng)率(gt(%))用公式(8)計(jì)算：

其中v0是在沒(méi)有進(jìn)一步培養(yǎng)的情況下立即測(cè)量的相應(yīng)細(xì)胞活力。在HeLa和4T1細(xì)胞系上也進(jìn)行了類似的處理，以估計(jì)MSNP介導(dǎo)的脫氧對(duì)細(xì)胞饑餓的普遍性。在給定時(shí)間(1小時(shí)和4小時(shí))收集的DOA饑餓MCF-7細(xì)胞用2.5%戊二醛和1%鋨酸固定、脫水、包埋，然后切成超薄切片，用于Bio-TEM(JEM-1400+)觀察細(xì)胞內(nèi)線粒體。

體外非接觸脫氧。為了模擬非接觸脫氧，將含有MS NPs的開(kāi)放式微離心管與培養(yǎng)盤內(nèi)的細(xì)胞共同培養(yǎng)。簡(jiǎn)言之，將MCF-7細(xì)胞(1×105個(gè)細(xì)胞，2毫升pH=7.4的DMEM)接種到培養(yǎng)盤中，并讓其附著過(guò)夜。然后，將裝有1毫升濃度為0、2、5和10毫摩爾MSNP緩沖溶液(pH=6.5)的微離心管與培養(yǎng)盤內(nèi)的細(xì)胞共培養(yǎng)。用Unisense氧微電極測(cè)量微離心管內(nèi)溶液和培養(yǎng)基外的溶解氧水平(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n=3)。這些原本密封的圓盤在測(cè)量后無(wú)法復(fù)原。密封培養(yǎng)24小時(shí)后，立即將細(xì)胞胰蛋白酶化、收獲、沖洗并重懸于500μl含有2μM Annexin V-FITC和4.5μM碘化丙啶(PI，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒)的結(jié)合緩沖液中。在黑暗中染色20分鐘后，用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)一式三份，獨(dú)立進(jìn)行。

動(dòng)物。用平均年齡為7周(20克)的雌性BALB/c小鼠進(jìn)行4T1腫瘤異種移植和相應(yīng)的體內(nèi)腫瘤饑餓療法評(píng)估。平均年齡為6周(20克)的雌性昆明小鼠用于評(píng)估MS NPs靜脈注射的潛在毒性。所有小鼠均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理規(guī)程進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分配，每籠五只，12h光/暗逆轉(zhuǎn)周期。

腫瘤模型。本研究采用了一種具有高度致瘤性和侵襲性的可移植小鼠4T1乳腺腫瘤模型。在BALB/c小鼠大腿皮下接種懸浮于100μl PBS中的1×106個(gè)4T1細(xì)胞，然后繼續(xù)喂養(yǎng)直到腫瘤體積達(dá)到100-130 mm3(腫瘤接種后10d)，以制備皮下4T1異種移植腫瘤模型。雙側(cè)和單側(cè)4T1異種移植腫瘤BALB/c小鼠分別通過(guò)靜注和靜脈注射DOA進(jìn)行腫瘤饑餓治療。