pHbrain測量


測量在自制的法拉第籠內進行，采樣頻率為4 Hz。pH選擇性微電極（外尖端直徑：50μm）購自Unisense，而玻璃參比微電極（外尖端直徑：~20μm，填充150 mM NaCl；電阻：~4-5x101?Ohm）為自制，并與Ag/AgCl絲電極一起使用。在每次實驗前，將電極安裝在立體定位操縱器上，在3種不同的預熱（38°C）緩沖溶液（pH分別為：6.10,7.10,和8.10）中進行校準。將仔豬頭部固定在立體定位框架中，縮回頭皮后，在額頂葉皮層上方制作兩個小圓形顱骨開窗（直徑≥5 mm），輕輕去除硬腦膜。將pH和參比微電極的尖端安裝到暴露的皮層內約1-2 mm深度，并將Ag/AgCl接地電極置于頭皮下方。使用定制構建的差分靜電計（>101?Ohm輸入阻抗；16 Hz低通截止）、16位模數轉換器和WinEDR軟件，或使用Microsensor Multimeter和SensorTrace Logger軟件記錄、數字化和存儲電極信號。離線評估記錄：通過應用線性回歸分析，將校準溶液中的信號與曲線擬合，并使用線性插值將數據轉換為pH值。由于該技術僅能可靠地穩定連續測量pHbrain 3-4小時，因此在不同的動物中，選擇不同的時間窗口進行評估（基線、PA和復蘇前4小時（n=6）、復蘇第8-14小時（n=8）和第20-24小時（n=3），如結果中所示）。


誘導窒息


手術后，1小時的恢復期允許監測的生理參數在獲取基線值之前穩定下來。通過將通氣從醫用空氣轉換為低氧高碳酸血癥氣體混合物（6%O?,20%CO?,平衡N?）20分鐘來誘導PA，同時將呼吸頻率降低至15次/分鐘，并停止液體/葡萄糖輸注。仔豬（n=13）用醫用空氣進行復蘇（呼吸頻率：30次/分鐘），持續實驗的剩余時間。


在另外三只動物中，在誘導PA之前，通過將吸入CO?從0%逐步增加至20%（每步5%，每次持續7-8分鐘）來評估分級正常氧高碳酸血癥對pHbrain的影響。分級高碳酸血癥后，恢復正常碳酸血癥30分鐘。這些動物在PA后2小時用過量戊巴比妥鈉（300 mg）實施安樂死。


神經病理學


神經病理學檢查的目的是測試窒息誘導的神經元損傷是否與我們之前使用該PA/HIE模型在窒息后24小時報告的結果相似。因此，在暴露于PA的13只仔豬中，僅包括那些維持24小時的動物（n=8）。在窒息結束24小時后，通過導管插入的頸總動脈用冷（4°C）生理鹽水灌注八只麻醉動物的腦組織。輕輕取出腦組織，并在進一步處理前浸入4°C的4%多聚甲醛溶液中固定。石蠟包埋的4μm切片用蘇木精-伊紅染色，并通過光學顯微鏡評估進行神經病理學評估。使用暗嗜酸性胞漿以及核固縮或核破裂的主要特征來識別受損神經元。在前額葉、頂葉、顳葉和枕葉皮層中，采用先前公布的評分系統測定腦皮質神經元損傷的程度。簡言之，在每個評估的皮質區域中，在20倍放大倍數下檢查20個不重疊的視野，確定神經元損傷的模式（無<分散<成群<全層）。然后，根據觀察到的最嚴重損傷模式的頻率（占20個檢查視野的百分比）對每個區域進行評分（0-9分）。按照[11,21]中的方法，通過在不重疊區域（分別在5-5-3個視野中；200倍放大倍數下）進行細胞計數來評估殼核、丘腦和海馬CA1區的神經元損傷。這些區域的神經元損傷以受損神經元的百分比表示。


統計分析


使用SigmaPlot（v12.0）或MATLAB環境離線分析結果并繪圖。神經病理學評分表示為中位數、25-75百分位數和5-95百分位數。所有其他數據表示為平均值±SEM。使用Shapiro-Wilk檢驗正態性。使用MATLAB的多項式曲線擬合計算PaCO?和pHbrain數據之間的相關性。參數數據采用單因素重復測量方差分析（RM ANOVA）進行比較，隨后進行Student-Newman-Keuls事后檢驗。顯著性水平（p）設定為0.05。


結果


PA期間和HIE發展過程中的pHbrain變化


誘導PA引起pHbrain降低，在20分鐘的損傷期間持續下降而未達到穩定，期間pHbrain從基線值7.21±0.03下降至窒息結束時的5.94±0.11（n=6；圖1A）。復蘇后，pHbrain在29.4±5.5分鐘內恢復至7.0，隨后穩定在幾乎與原始基線無法區分的水平。此后，從2小時起，pHbrain保持在略低于基線的水平（平均低0.10±0.02 pH單位），在24小時隨訪期內任何觀察時間點均未顯示明顯改變（圖1B）。

在20分鐘PA期間，氧飽和度降至30%以下，HR在最初2分鐘內從約140次/分鐘增加至近200次/分鐘，之后未顯示重大變化，而MABP的反應是雙相的，先短暫升高至約90 mmHg，隨后緩慢下降至基線以下（圖2）。在復蘇的最初2-3分鐘內，氧飽和度迅速恢復至80%以上，同時HR和MABP短暫升高至240次/分鐘和80 mmHg以上，之后信號逐漸恢復正常。

長期監測生理參數很好地反映了PA和復蘇的預期效果。血液血紅蛋白濃度（基線：8.0±0.3 g/dl；時間進程未圖示）、核心體溫（通過加熱控制，見方法）、氧飽和度、MABP和HR在PA前的基線處于正常范圍內，并且在整個存活期間的值與基線無顯著差異。


除脈搏血氧測定數據外，PA結束時的動脈血氣分析也證實了中心血紅蛋白去飽和的發展（從94±4%降至13±4%），并伴有嚴重酸中毒、低氧血癥和高碳酸血癥。


實際上，動脈血pH（pHa）從7.53±0.03下降至6.79±0.02是顯著的，并伴隨著PaCO?升高至160±6 mmHg，然而，pHa仍比pHbrain高0.8個pH單位以上。血糖和乳酸水平也顯著升高，表明了對PA的代謝反應。堿剩余大幅下降17.4±1.5 mmol/L和碳酸氫鹽濃度降低，連同PA結束時低的pHa（6.79）表明，窒息發展程度遠超人類新生兒嚴重BA的關鍵臨床標準（pH&lt;7.0且堿缺失≥12至16 mmol/L）。復蘇迅速恢復了動脈血中的正常氧合狀態，但PaCO?水平仍略有升高，盡管該變化僅在4小時時有統計學意義。此時堿剩余已恢復正常，pHa恢復至7.39±0.02，這對仔豬而言是正常值。以類似的方式，血糖和乳酸水平也在4小時時恢復至基線，盡管兩者在PA后1小時時仍顯著升高。

神經病理學分析通過在所有檢查的新皮質區域（圖4A和4C）以及海馬CA1區、丘腦和殼核（圖4B）顯示中度/重度神經元損傷，證實了HIE的發展。這些發現與之前使用相同PA應激報告的神經元損傷一致。