摘要

背景：腦間質pH（pHbrain）改變在圍產期窒息引起的新生兒缺氧缺血性腦病（HIE）的神經元損傷機制中起重要作用。新生豬是研究HIE的成熟大動物模型，但關于該物種pHbrain改變的信息有限，且僅限于實驗性圍產期窒息（PA）和立即復蘇階段。因此，我們旨在測定仔豬HIE發展最初24小時內的pHbrain變化。

方法：對麻醉、通氣的新生豬（n=16）進行器械操作以控制主要生理參數。使用pH微電極在頂葉皮層測定pHbrain。通過用含6%O?-20%CO?的氣體混合物通氣20分鐘誘導PA，然后用空氣復蘇24小時，隨后對腦組織進行組織病理學評估。

結果：在PA期間，核心溫度保持不變（基線versus PA結束時：38.4±0.1 vs 38.3±0.1°C；平均值±SEM）。在動脈血中，PA導致嚴重低氧血癥（PaO?:65±4 vs 23±1 mmHg,p<0.05）以及酸中毒（pHa:7.53±0.03 vs 6.79±0.02），這與觀察到的高碳酸血癥（PaCO?:37±3 vs 160±6 mmHg）和乳酸血癥（1.6±0.3 vs 10.3±0.7 mmol/L）一致。同時，pHbrain從7.21±0.03逐漸下降至5.94±0.11*。復蘇在4小時內恢復了pHa、血氣及代謝物水平，但PaCO?仍略有升高。pHbrain在29.4±5.5分鐘內恢復至7.0，隨后恢復至基線水平，并在24小時觀察期內未出現繼發性改變。神經病理學評估也證實了神經元損傷。

結論：盡管在實驗性PA期間存在嚴重酸中毒和血氣改變，但pHbrain恢復迅速，且值得注意的是，未出現許多HIE嬰兒中常見的窒息后低碳酸血癥。因此，在我們的仔豬模型中，神經元損傷與PA后最初24小時內異常的pHbrain或低PaCO?無關。

引言

圍產期窒息（PA）定義為分娩前后氧氣供應中斷，是全球新生兒死亡和長期神經殘疾的主要原因之一。胎盤或肺氣體交換中斷會立即引發代謝改變（低氧血癥、高碳酸血癥和混合性酸中毒），從而觸發心血管反應，以利于維持心肌和大腦（即中心循環）的氧氣輸送。當這些代償機制耗盡時，會發生嚴重的組織缺氧/缺血，隨后的代謝危象將導致存活者出現缺氧缺血性腦病（HIE）。

盡管治療性低溫在減輕PA/HIE不良結局方面具有部分療效，但仍需要臨床前動物模型來研究HIE發展的精確病理生理學，并測試推定的神經保護方法。與人類PA/HIE綜合征的病因、嚴重程度和持續時間異質性類似，臨床前模型在物種、動物的產前/產后年齡、誘導PA/HIE的方法以及窒息后觀察期的長度方面也存在相當大的異質性。這些差異使得積累的數據不易比較和轉化。新生豬長期以來被確定并接受作為研究足月新生兒的通用臨床前模型。兩個物種在大腦結構、代謝、發育以及腦血管生理學方面存在許多重要的相似之處，這使得仔豬適合進行轉化性PA/HIE研究。我們最近發表了一種新生仔豬PA/HIE模型，該模型產生了人類PA/HIE的主要特征，并能引發顯著的神經元損傷，但未包含在人類中從未或極少發生的操作，如雙側頸動脈閉塞或短暫性出血性低血壓。

在本研究中，我們著手研究仔豬模型中PA期間和HIE發展亞急性期腦間質pH（pHbrain）的變化過程。在HIE患者中，使用磁共振波譜（MRS）技術在年齡<2周時發現腦細胞內pH（pHi）水平相當高。這種堿中毒持續數月并與不良神經結局相關，所描述的pH改變可能是所謂的繼發性能量衰竭的特征之一。然而，pHi的變化可能不能真實反映pHbrain的改變，因為跨膜pH梯度在HIE發展過程中會發生改變，而且細胞內和細胞外pH通過不同的靶點改變大腦活動和能量消耗。關于PA/HIE引起的仔豬pHbrain變化的數據非常有限，并且這些研究未能在缺氧缺血應激完成后4小時之后追蹤pHbrain的進程。我們現在在我們充分表征的仔豬PA/HIE模型中報告定量腦皮質pHbrain數據，包括PA期間和HIE發展的最初24小時。

材料與方法

所有涉及動物的實驗程序均經過三步流程批準。首先，詳細的實驗計劃由塞格德大學機構動物護理和使用委員會（IACUC）仔細審查并批準。其次，向國家動物實驗倫理委員會請求批準IACUC認可的實驗計劃。第三，匈牙利政府代表機構Csongrad縣國家食品鏈安全與動物健康理事會根據ATET建議頒發許可（許可號：XIV./1414/2015）。所有動物實驗均符合（1）匈牙利科學院動物實驗科學委員會的指南，（2）歐盟關于用于科學研究的動物保護的指令2010/63/EU，以及（3）ARRIVE指南。此外，我們聲明本研究中所有程序均在麻醉動物身上進行，所有動物均被麻醉并用鎮痛藥治療，在整個觀察期（24小時）內進行生命體征的強化監測，無預期或觀察到的死亡率。實驗結束時，用過量戊巴比妥鈉（300 mg）對動物實施安樂死。

新生（≤1日齡）雄性長白豬（體重：1.5-2.5 kg，n=16）從當地公司獲得，并在實驗當天早晨送至實驗室。通過硫噴妥鈉（45 mg/kg ip）誘導麻醉。仔豬通過氣管切開術插管，并通過壓力控制的小動物呼吸機用溫暖的濕化醫用空氣（21%O?，平衡N?）進行人工通氣，可選擇性地補充O?。調整呼吸設置（吸入氧濃度：0.21-0.25；呼吸頻率：30-35次/分鐘，峰值吸氣壓：120-135 mmH?O）以維持血氣值和氧飽和度在生理范圍內。在無菌條件下對右股靜脈進行導管插入，以通過推注嗎啡（100μg/kg）和咪達唑侖（250μg/kg），然后持續輸注嗎啡（10μg/kg/h）、咪達唑侖（250μg/kg/h）和液體（5%葡萄糖，0.45%NaCl 3-5 ml/kg/h）來維持麻醉/鎮痛。將第二根導管置入右頸動脈，用于連續監測平均動脈壓（MABP）和心率（HR）。

選擇該動脈是因為結扎股動脈會在24小時復蘇期間導致后肢嚴重缺血（個人觀察），相反，單側頸動脈閉塞已被證明不影響腦血流。連續測量直腸溫度，并通過伺服控制的水循環加熱冷卻墊維持在生理范圍內（38.5±0.5°C）。使用Hewlett-Packard M1094監測儀連續監測氧飽和度、MABP和HR，并在線記錄。這些參數在基線、PA期間以及隨后在每個復蘇小時開始時記錄10分鐘。用血液分析系統分析動脈血樣本（~300μl/樣本），在基線、窒息結束時以及之后至20小時的選擇時間點測定動脈血pH、氣體張力、堿剩余、中心氧飽和度、血紅蛋白、碳酸氫鹽、葡萄糖和乳酸濃度。靜脈給予預防性抗生素：青霉素（50 mg/kg/12 h）和慶大霉素（2.5 mg/kg/12 h）。在窒息后12小時通過恥骨上穿刺引流膀胱。