3.2 H2-MBs可以通過超聲成像可視化。

由于MBs是增強(qiáng)超聲成像最常用的對(duì)比劑，因此檢查了H2-MBs在體外和大鼠心臟中的成像效果。結(jié)果表明，H2-MBs引起了有效的超聲回波響應(yīng)，超聲信號(hào)的強(qiáng)度與濃度成正比（圖2a）。定量分析顯示，超聲信號(hào)的強(qiáng)度分別為1×105、1×106、1×107、1×108和1×109個(gè)H2-MBs/mL時(shí)分別為43.01±1.29、57.86±1.45、88.29±0.76、114.68±0.74和161.04±1.48 dB（圖2b）。此外，還比較了大鼠心臟左心室（LV）注射H2-MBs前后的成像效果，結(jié)果顯示注射H2-MBs后超聲信號(hào)顯著增強(qiáng)，與注射前相比有顯著增強(qiáng)（圖2c）。定量分析顯示，H2-MBs注射后信號(hào)強(qiáng)度迅速增加，注射后2分鐘達(dá)到最大水平（123.39±6.34 dB），然后在5分鐘后下降至87.86±8.12 dB（圖2d）。此外，我們發(fā)現(xiàn)H2-MBs可以進(jìn)入大鼠心肌組織（圖2e）。注射H2-MBs后，心肌組織的超聲信號(hào)強(qiáng)度比注射前增加了2.83倍（P<0.01）（圖2f）。高能量破壞脈沖能夠破壞H2-MBs，并導(dǎo)致超聲信號(hào)強(qiáng)度顯著降低，證實(shí)了心肌組織中存在H2-MBs（圖S5）。

圖2.H2-MBs的超聲信號(hào)檢測(cè)。（a）H2-MBs分散在各種濃度（5×105、5×106、5×107、5×108和5×109/mL）的PBS中的超聲圖像。使用Vevo 2100超聲成像系統(tǒng)進(jìn)行成像。（b）PBS中H2-MBs的超聲信號(hào)強(qiáng)度的定量分析。（c）大鼠心臟LV中H2-MBs在靜脈尾部注射H2-MBs前后的超聲圖像。使用Vevo 2100超聲成像系統(tǒng)進(jìn)行成像（n=3）。上排，注射H2-MBs前；下排，注射H2-MBs后；左側(cè)面，B模式圖像；右側(cè)面，對(duì)比模式圖像；LV，左心室（點(diǎn)線循環(huán)）。（d）H2-MBs注射進(jìn)入大鼠后300秒的時(shí)間-強(qiáng)度曲線。箭頭表示MB注射的時(shí)間。（e）大鼠心肌組織中H2-MB輸送的超聲圖像。使用Philips IE33超聲機(jī)進(jìn)行成像。左側(cè)，注射H2-MBs前；右側(cè)，注射H2-MBs后；LV，左心室（紅色循環(huán)）；IVS，心室間隔（藍(lán)色循環(huán)）；RV，右心室（綠色循環(huán)）。箭頭表示靜脈注射H2-MBs后H2-MB輸送到大鼠心肌組織中的情況。（f）H2-MBs的超聲信號(hào)強(qiáng)度的定量分析（n=3）。**P<0.01。數(shù)據(jù)表示平均值±s.d.

3.3 H2-MBs限制心肌梗死面積。

然后，我們調(diào)查了不同劑量的H2-MBs對(duì)心肌缺血再灌注損傷后梗死面積的影響。大鼠經(jīng)歷30分鐘的缺血和24小時(shí)的再灌注。左冠狀動(dòng)脈（LCA）閉塞后，通過心電圖（ECG）S-T段抬高確認(rèn)缺血（圖S6），然后在再灌注前將H2-MBs或載體以低劑量（4×109個(gè)泡沫）或高劑量（2×1010個(gè)泡沫）濃度注入尾靜脈。圖3a顯示了載體或H2-MB（高劑量）處理的大鼠的代表性橫截面。評(píng)估梗死面積顯示，高劑量H2-MBs顯示出比低劑量H2-MBs更顯著的細(xì)胞保護(hù)作用（P<0.01）（圖3b）。接受高劑量H2-MBs的大鼠顯示出12.81±3.21％的梗死面積，而與接受載體處理的大鼠（INF/LV：42.67±2.60％）相比，梗死面積減少了69.97％。相比之下，接受低劑量H2-MBs的大鼠顯示出較少的細(xì)胞保護(hù)作用，梗死面積為26.21±3.10％，僅減少了38.57％。我們還檢查了高劑量H2-MBs對(duì)經(jīng)歷30分鐘缺血和3小時(shí)再灌注的大鼠的保護(hù)作用，梗死面積評(píng)估顯示梗死面積減少了28.06％（P<0.05）（圖3c）。

圖3.H2-MBs預(yù)防心肌梗死。（a）給予對(duì)照微泡（左）或H2-MBs（右，高劑量）處理的大鼠經(jīng)TTC染色的心肌連續(xù)切片的代表性圖像。被染色陽性（紅色）的組織代表活力心肌。未染色陽性（白色）的心肌代表梗死組織。（b）對(duì)于接受假手術(shù)處理的、接受車輛處理的或接受H2-MB處理的大鼠（低劑量，每只大鼠4×109氣泡；高劑量，每只大鼠2×1010氣泡）在LCA缺血30分鐘和再灌注24小時(shí)后的心肌梗死面積的定量測(cè)定。接受H2-MB處理的大鼠顯示出INF/LV顯著減少（n=7）。*P<0.05，**P<0.01。數(shù)據(jù)表示平均值±s.d。（c）對(duì)于接受假手術(shù)處理的、接受對(duì)照MB處理的或接受H2-MB處理的大鼠在LCA缺血30分鐘和再灌注3小時(shí)后的心肌梗死面積的定量測(cè)定；每只H2-MB處理的大鼠使用2×1010個(gè)H2-MBs。發(fā)現(xiàn)了類似的保護(hù)作用（n=5）。**P<0.01。數(shù)據(jù)表示平均值±s.d.

3.4 H2-MBs保護(hù)LV結(jié)構(gòu)和功能。

為了確定H2-MBs對(duì)病理性LV重塑的影響，使用超聲心動(dòng)圖監(jiān)測(cè)了LV形態(tài)和功能，在經(jīng)歷30分鐘的LCA缺血和24小時(shí)的再灌注后。與假手術(shù)處理的大鼠相比，載體處理的大鼠顯示出心肌梗死后不良的病理性重塑。值得注意的是，在再灌注前注射H2-MBs可以減輕心肌梗死后的病理性重塑（圖4a）。此外，接受H2-MBs處理的大鼠的左室舒張末期直徑（LVEDD）和左室收縮末期直徑（LVESD）與接受假手術(shù)處理的大鼠相比沒有顯著增加。相反，在心肌缺血再灌注后，接受載體處理的大鼠顯示出顯著增加的LVESD和LVEDD值（圖4b）。此外，接受載體處理的大鼠在心肌缺血后顯示出21.68％和15.81％的射血分?jǐn)?shù)和短軸分?jǐn)?shù)減少，而接受H2-MBs的大鼠顯示出8.44％和7.21％的射血分?jǐn)?shù)和短軸分?jǐn)?shù)減少，分別較少（圖4c）。

圖4.H2-MBs減少不良的LV重塑。（a）接受假手術(shù)處理（假手術(shù)）、缺血再灌注對(duì)照微泡處理或缺血再灌注H2-MBs處理的大鼠的代表性M模式超聲心動(dòng)圖像。對(duì)每組的M模式超聲圖像的測(cè)量是在缺血再灌注后48小時(shí)進(jìn)行的。使用裝備有MS-250掃描頭探頭的Vevo 2100系統(tǒng)進(jìn)行成像，掃描速度為1000 Hz，頻率為21 MHz。刻度條（垂直），4 mm。（b）基于超聲心動(dòng)圖像，確定了LV尺寸，包括左室舒張末期直徑（LVEDD）和左室收縮末期直徑（LVESD）（n=5）。**P<0.01。數(shù)據(jù)表示平均值±s.d。（c）與對(duì)照組相比，H2-MB處理的大鼠的心臟收縮功能（FS％）和射血分?jǐn)?shù)（EF％）顯著改善（n=5）。**P<0.01。數(shù)據(jù)表示平均值±s.d。