摘要：缺血再灌注誘導的心肌細胞死亡是全球發病率和死亡率的主要原因。氫氣（H2）作為一種抗氧化劑，已經顯示出在預防和治療缺血再灌注引起的致命損傷方面具有巨大潛力。然而，由于H2在水中溶解度較低，在血液和受損組織中的生物利用度較差。在這里，我們開發了一種超聲可視的H2傳遞系統，通過將H2裝載在微泡內（H2-MBs）來防止心肌缺血再灌注損傷。使用該系統，可以在常溫和常壓條件下大大提高單位體積中的H2濃度。H2-MBs可以在超聲成像系統中進行可視跟蹤，并能有效釋放其治療氣體。在缺血再灌注開始時在活體系統中輸注H2-MBs會導致明顯減小的梗死區大小和病理重塑。進一步分析表明，這種方法顯著抑制了心肌細胞凋亡，并減少了心肌缺血再灌注大鼠中的心肌炎癥和氧化損傷。這些結果表明，H2-MBs是一種有前途的H2基治療應用的可視傳遞系統。

1引言

心肌缺血再灌注損傷已被廣泛接受為組織破壞和可能的心力衰竭刺激。當冠狀動脈的一個或多個分支狹窄或閉塞時，心臟將失去氧氣血液供應，隨后的灌注和再氧化通常會導致組織損傷加劇。病理上，缺血再灌注損傷的一個潛在機制是受損心肌組織中活性氧自由基（ROS）的過度產生，特別是在再灌注的最初幾分鐘內。ROS的產生觸發線粒體通透性過渡孔的開放，并導致一系列病理過程，包括各種細胞死亡程序、微血管功能障礙和炎癥級聯。

迄今為止，已經嘗試使用一氧化氮、一氧化碳和硫酸氫鹽等治療氣體來減輕心肌缺血再灌注損傷。大多數這些技術在實驗室中表現出了前景，但在臨床應用中的結果則不那么令人鼓舞。一個關鍵問題源于這些氣體的固有毒性。最近，氫氣（H2），作為最知名的分子之一，被提出對缺血再灌注損傷引起的器官功能障礙具有潛在的預防和治療作用。與其他治療抗氧化劑相比，H2的有效性已經在其他模型中廣泛證明。與其他治療抗氧化劑相比，H2具有許多獨特的優點，包括：（i）其選擇性減少最細胞毒性的ROS羥自由基，并在不干擾代謝氧化還原反應或破壞其他ROS參與細胞信號傳導和其他生理作用的情況下有效保護細胞；（ii）能夠穿透生物膜并擴散到細胞質、線粒體和細胞核中（其快速的氣態擴散可能使其在減少細胞毒性自由基方面非常有效）；（iii）更重要的是，H2是一種對人類沒有明顯副作用的安全氣體。

傳統上，以下三種策略用于提供H2治療應用：（i）直接吸入H2氣體，（ii）飲用溶解在水中的氫氣，或（iii）靜脈/腹腔注射氫氣飽和鹽水。然而，所有傳遞策略的效果都取決于H2在水、鹽水或血液中的溶解度。不幸的是，H2在水溶劑中溶解度較低，導致其在血液和受損組織中的生物利用度較差。此外，H2的易燃性在制備含H2配方時造成了巨大的困難和安全隱患。此外，目前尚無可用于生物醫學應用的圖像引導的H2傳遞系統。這些限制激發了尋找新的、安全的H2傳遞系統以有效治療的動力。

微泡（MBs）是一種充滿氣體的小型微球體。長期以來，微泡因其在超聲診斷中作為造影劑的臨床應用而備受關注。除此之外，微泡還是重要的藥物遞送載體，能夠在血液循環中穩定攜帶藥物并具有多種治療應用。藥物可裝載在微泡外殼上、嵌入外殼基質中或填充到內部空腔。近期研究報道了微泡作為封裝治療性氣體載體的應用。本文通過大鼠模型實驗，我們首次展示了載氫微泡（H2-MBs）作為抗氧化劑預防心肌缺血-再灌注損傷的潛力。

2材料和方法

2.1 H2-MBs的制備

以氯仿為溶劑，將購自Avanti Polar Lipid公司的1,2-二硬脂酰-sn-甘油磷酰膽堿（DSPC）和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基（聚乙二醇）-2000]（季銨鹽，DSPE-PEG2000）按摩爾比90：10混合。將溶劑用穩定的氮氣流蒸發到玻璃管上形成薄膜。然后將磷脂膜置于真空下約2小時，完全去除溶劑。然后，將干燥的磷脂膜在60℃下與含有甘油、1,2-丙二醇和0.1M三聚氰胺緩沖液的5mL緩沖液中水合，體積比為10：10：80，然后超聲處理直至脂質膜完全分散。隨后，將超聲處理的磷脂懸濁液轉移到密封的4mL玻璃瓶中（每瓶約1mL），并使用自行設計的裝置將瓶中氣體用八氟丙烷（C3F8）置換。將含有磷脂懸濁液和C3F8的瓶子用振蕩器（MONITEX膠囊攪拌器，轉速4500 rpm）機械振動45 s，得到對照MBs（載體）。為制備H2-MBs，通過1mL注射器向倒置的瓶中注入一定量的H2，然后通過另一個針頭擠出較重的C3F8氣體。然后，像上面提到的那樣，對這些瓶子進行機械振動，以獲得H2-MBs。

2.2 H2釋放曲線的測量

根據先前的研究，使用針式氫氣電極（Unisense）在磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）和血液中測量H2釋放曲線。簡要地說，向5mL PBS中加入0.2 mL H2-MBs或對照MBs（載體）。然后，通過將針式氫氣電極浸入MB懸浮液中并實時記錄數據來確定H2釋放曲線。對于體內H2釋放曲線，將針式氫氣電極插入五只健康大鼠的左心室（動脈血），并通過靜脈注射向大鼠注入2×1010 H2-MBs或對照MBs。然后連續記錄血液中H2的濃度。

2.3超聲成像

使用專用于小動物的高分辨率超聲成像系統（Vevo 2100；VisualSonics，加拿大多倫多）或使用IE33超聲機（Philips Medical Systems，MA）對H2-MBs進行超聲成像。對于體外線性B模式超聲成像實驗，向透明袋中添加各種濃度（5×105，5×106，5×107，5×108或5×109/mL PBS）的H2-MBs；PBS用作對照。然后將袋子浸入水浴中，使用Vevo 2100成像系統進行超聲成像，參數如下：探頭MS-400；增益25 dB；焦深4?6 mm；發射功率30%；機械指數0.2；動態范圍60 dB，幀率25 Hz；中心頻率40 MHz。對于體內增強超聲成像實驗，將三只健康大鼠麻醉后，以1.5%異氟醚吸入，固定在仰臥位，然后用Vevo 2100成像系統對大鼠的左心室腔內的H2-MBs進行成像，參數如下：探頭MS-250；增益20 dB；焦深21?23 mm；發射功率10%；機械指數0.2；動態范圍40 dB，幀率17 Hz；中心頻率18 MHz。為了檢測已輸送到心肌組織中的H2-MBs，使用Philips IE33超聲機對心臟進行成像，參數如下：探頭S5-1；增益44 dB；焦深1?3 cm；動態范圍50 dB；幀率40 Hz；中心頻率3 MHz。信號強度由QLAB軟件定量。