Western印跡：


按照說明使用含1mMPMSF的RIPA緩沖液對回腸組織進行勻漿。組織勻漿在冰上裂解30分鐘后，離心5分鐘（4°C，12000g/min）收集上清液。在進行Western印跡前，使用BCA蛋白檢測試劑盒對總蛋白濃度進行定量。將適當的蛋白質樣品與SDSPAGE上樣緩沖液混合，在95℃下變性10分鐘。在8%或10%的SDS-PAGE凝膠中進行電泳，然后將蛋白質轉移到PVDF膜上。在室溫下用5%BSA將膜孵育2小時以阻斷非特異性結合。然后用一抗（表1）在4°C下孵育過夜。室溫下用HRP-山羊抗小鼠或兔IgG二抗（稀釋度1:5000）孵育1小時，然后用ECL化學發光系統檢測蛋白。用ImageJ軟件分析膜的密度。


統計分析：


所有分析均采用GraphPad Prism7軟件進行。統計分析采用單向方差分析。數據以平均值±平均值標準誤差(SEM)表示。如果p值小于0.05，則認為統計差異顯著。


結果：


1.HRS對大鼠回腸損傷的影響

圖2光鏡下觀察回腸損傷。(A)H&E染色（200×，400×）：Sham組黑色箭頭表示正常黏膜絨毛；I/R組紅色箭頭表示絨毛變性，固有膜暴露；HRS組藍色箭頭表示上皮下間隙擴展；4PBA組黃色箭頭表示Gruenhagen間隙。(B）組織病理學評分。


四組回腸組織病理學變化見圖2A。Sham組的回腸組織切片沒有病理變化，粘膜絨毛正常。I/R組的絨毛變性，固有膜外露，毛細血管擴張。HRS組回腸絨毛輕度水腫，部分絨毛塌陷。4-PBA組的絨毛頂端出現上皮下間隙擴展?；啬c組織的Chiu評分見圖2B。I/R組回腸組織學損傷評分（5.67±0.33）明顯高于假手術組（1.33±0.33）。HRS組（3.67±0.33）和4-PBA組（3.33±0.33）的得分明顯低于I/R組。血清（IFABP）的變化也反映了類似的模式（表2）。與Sham組（1.98±0.07ng/ml）相比，I/R組的血清IFABP水平（2.78±0.26ng/ml）顯著升高。服用HRS后，IFABP水平明顯降低（2.10±0.11ng/ml）。然而，與I/R組相比，4-PBA并未降低IFABP水平的升高（2.38±0.05ng/ml）。


2.HRS對IIRI誘導的炎癥細胞因子的影響

表2：各組血清IFABP、TNF-α和IL-1β水平。


與Sham組（57.30±6.19ng/L）相比，I/R組的血清TNF-α水平（113.40±15.76ng/L）明顯更高。與I/R組相比，HRS組（62.02±10.60ng/L）和4-PBA組（59.17±7.24ng/L）的TNF-α水平明顯降低。血清IL-1β水平的變化也反映了類似的模式（表2）。與Sham組（16.11±1.71ng/L）相比，I/R組的血清IL-1β水平（29.11±1.72ng/L）明顯更高。HRS組（21.68±0.17ng/L）和4-PBA組（18.45±1.66ng/L）的IL-1β水平顯著低于I/R組。


3.HRS對腸上皮緊密連接蛋白的影響

圖3腸上皮緊密連接蛋白的位置和表達（A）IHC（200×）：腸上皮細胞間的棕色沉淀為閉塞蛋白的位置。(B)用IHC檢測包被蛋白的表達。(C）IF（200×）：紅色箭頭所指的綠色熒光為ZO-1蛋白的位置。(D、E）Western印跡顯示閉塞素蛋白的表達水平。(D，F）Western印跡顯示ZO-1蛋白的表達水平。


I/R組的閉塞素蛋白表達水平（0.53±0.04）明顯低于Sham組（1.00±0.00）。HRS組（0.81±0.03）和4-PBA組（0.72±0.05）的閉塞素蛋白表達水平明顯高于I/R組。紅色箭頭所指的綠色熒光是Zonulaoccludens-1（ZO-1）蛋白的位置（圖3C）。與Sham組、HRS組和4-PBA組相比，I/R組的熒光強度明顯降低。Western印跡結果見圖3D-F。HRS組閉塞蛋白的表達水平（0.79±0.04）高于I/R組（0.54±0.03）。但在4-PBA組（0.69±0.06）中沒有統計學意義。HRS組（0.91±0.06）和4-PBA組（0.88±0.01）的ZO-1蛋白表達水平顯著高于I/R組（0.51±0.08）。


4.HRS對ERS核心蛋白的影響

圖4 ERS核心蛋白的位置和表達(A)IHC（200×）：腸上皮細胞胞漿中的棕色沉淀是GRP78蛋白的位置。(B）通過IHC檢測GRP78蛋白的表達。(C）IF（100×）：紅色箭頭所指的綠色熒光為GRP78蛋白的位置。(D、E）Western印跡檢測GRP78蛋白的表達水平。(D,F)Western印跡檢測XBP1s蛋白的表達水平。


I/R組葡萄糖調節蛋白（GRP78）的表達水平（1.901±0.18）明顯高于Sham組（1.00±0.00）。HRS組（1.19±0.16）和4-PBA組（1.26±0.15）的GRP78蛋白表達水平明顯低于I/R組。紅色箭頭所指的綠色熒光是GRP78蛋白的位置（圖4C）。與Sham組、HRS組和4-PBA組相比，I/R組的熒光強度明顯增加。Western印跡結果見圖4D-F。HRS組（1.41±0.04）和4-PBA組（1.49±0.10）的GRP78蛋白表達水平明顯低于I/R組（1.96±0.12）。HRS組（1.44±0.16）和4-PBA組（1.37±0.16）的X-box結合蛋白-1s(XBP1s)蛋白表達水平明顯低于I/R組（2.27±0.16）。


5.HRS對ERS誘導細胞凋亡的核心蛋白的影響

圖5 RS誘導細胞凋亡的核心蛋白的位置和表達(A)IHC（200×）：腸上皮細胞胞漿和細胞核中的棕色沉淀是caspase-3蛋白的位置。(B）通過IHC檢測Caspase-3蛋白的表達。(C）IF（100×）：紅色箭頭所指的綠色熒光為CHOP蛋白的位置。(D、E）CHOP蛋白的表達。(D，F）caspase-3蛋白的表達。


I/R組caspase-3蛋白的表達水平（3.33±0.23）明顯高于Sham組（1.00±0.00）。HRS組（1.61±0.13）和4PBA組（1.62±0.12）的caspase-3蛋白表達水平明顯低于I/R組。紅色箭頭所指的綠色熒光是C/EB同源蛋白（CHOP）蛋白的位置（圖5C）。與Sham組、HRS組和4-PBA組相比，I/R組的熒光強度明顯增加。Western印跡結果見圖5D、E、F。Caspase-3蛋白在HRS組（1.50±0.19）和4-PBA組（1.49±0.19）的表達水平明顯低于I/R組（2.40±0.26）。HRS組（1.43±0.15）和4-PBA組（1.48±0.12）的CHOP蛋白表達水平明顯低于I/R組（2.40±0.20）。