與離體間充質(zhì)干細(xì)胞相比，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)形成的球狀體顯示出更高的細(xì)胞存活率和營(yíng)養(yǎng)因子分泌量，使其在細(xì)胞療法方面具有治療優(yōu)勢(shì)。目前，人們對(duì)其作用機(jī)制尚未達(dá)成共識(shí)。許多人假設(shè)，球體的形成是通過(guò)在直徑足夠大的球體內(nèi)產(chǎn)生一個(gè)缺氧核心來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞功能的。本研究的目的是通過(guò)測(cè)量直徑不斷增大的間充質(zhì)干細(xì)胞球體內(nèi)的氧分壓，并將氧分壓值與細(xì)胞功能相關(guān)聯(lián)，從而通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定間充質(zhì)干細(xì)胞球體內(nèi)是否會(huì)產(chǎn)生缺氧核心。每個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞球體由15000、30000或60000個(gè)細(xì)胞組成，半徑分別為176±8μm、251±12μm和353±18μm。氧分壓值和數(shù)學(xué)模型顯示，在最大的球體內(nèi)，氧分壓梯度與外徑的變化不到10%。盡管氧分壓的徑向變化不大，但隨著細(xì)胞數(shù)量和球體大小的增加，球體的細(xì)胞代謝顯著下降。這可能是由于隨著球體直徑的增加，基質(zhì)沉積和堆積密度適應(yīng)性降低，從而使球體避免形成缺氧核心?？傊?，這些數(shù)據(jù)提供了間充質(zhì)干細(xì)胞球體功能增強(qiáng)并非由氧氣介導(dǎo)的證據(jù)。

1引言

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是目前廣泛研究的再生療法。然而，要將間充質(zhì)干細(xì)胞療法轉(zhuǎn)化為臨床實(shí)踐，面臨的一大挑戰(zhàn)是確保間充質(zhì)干細(xì)胞移植到缺損部位后的存活率和功能。先前的研究報(bào)告指出，缺血情況下細(xì)胞的高死亡率和低接合率降低了干細(xì)胞療法的療效，因?yàn)橹挥胁坏?%的間充質(zhì)干細(xì)胞在移植到缺血缺損部位4天后存活。出現(xiàn)這些并發(fā)癥的可能原因包括移植到缺氧和炎癥環(huán)境中，以及從培養(yǎng)皿中收獲擴(kuò)增細(xì)胞時(shí)常用的蛋白水解酶處理導(dǎo)致培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)丟失。

我們和其他人已經(jīng)證明，間充質(zhì)干細(xì)胞形成三維球體后，整體功能增強(qiáng)，存活率提高。與同等數(shù)量的離體間充質(zhì)干細(xì)胞相比，15000個(gè)細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞球體表現(xiàn)出相似的Caspase3/7蛋白酶活性，但分泌的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子卻高達(dá)100倍。用更多間葉干細(xì)胞形成的較大球體，其Caspase活性增加，代謝活性和增殖減少。由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)臄U(kuò)散長(zhǎng)度受到限制，因此必須仔細(xì)考慮球體的大小，這一特點(diǎn)可能會(huì)使半徑大于200μm的球體核心細(xì)胞容易缺氧和死亡。有人推測(cè)，球體內(nèi)缺氧核心的存在可能會(huì)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)編程，以促進(jìn)細(xì)胞存活并增強(qiáng)其營(yíng)養(yǎng)因子的分泌。因此，使用半徑接近營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸限制的球體可能會(huì)帶來(lái)額外的優(yōu)勢(shì)，但如果半徑超過(guò)營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸限制則不會(huì)。然而，對(duì)于這種缺氧核心是否存在或是否是增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞球體功能的必要條件，文獻(xiàn)中還存在分歧。

以前使用癌細(xì)胞和肝細(xì)胞進(jìn)行的研究使用了氧微電極來(lái)測(cè)量它們的穩(wěn)態(tài)氧值，而其他研究則生成了預(yù)測(cè)性數(shù)學(xué)模型，但無(wú)法直接測(cè)量氧分壓值來(lái)驗(yàn)證模型。雖然已有大量建模研究致力于研究球體內(nèi)的運(yùn)輸現(xiàn)象，但之前的研究是針對(duì)以不同速度消耗氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的非多介質(zhì)細(xì)胞群體進(jìn)行的。此外，間充質(zhì)干細(xì)胞形成球狀體的意義與癌細(xì)胞和肝細(xì)胞大不相同，因?yàn)殚g充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)不會(huì)自然形成球狀體，而是作為一種工具，使細(xì)胞能夠最大限度地分泌營(yíng)養(yǎng)因子。最后，不同類型細(xì)胞的堆積密度和孔隙率不同，導(dǎo)致擴(kuò)散速度也不同。

本研究的目的是評(píng)估間充質(zhì)干細(xì)胞球體內(nèi)的氧分壓曲線，以確定是否存在缺氧核心，進(jìn)而將細(xì)胞存活與這些聚集體中的氧供應(yīng)相關(guān)聯(lián)。我們使用氧微電極測(cè)量直徑不斷增大的球體內(nèi)氧分壓與半徑的函數(shù)關(guān)系。數(shù)據(jù)被用于使用數(shù)學(xué)模型對(duì)球體內(nèi)的氧梯度進(jìn)行數(shù)值描述。我們測(cè)量了細(xì)胞活力和新陳代謝與球體大小的函數(shù)關(guān)系。最后，我們測(cè)量了球體直徑和堆積密度，以研究細(xì)胞在較大球體內(nèi)存活的潛在途徑。這些研究結(jié)果加深了我們對(duì)球體大小、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸和細(xì)胞功能之間相互作用的理解。

2材料與方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)

使用來(lái)自兩名供體的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，無(wú)需進(jìn)行其他表征。間充質(zhì)干細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件(37℃、21%O2、5%CO2)下，在添加了10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的最小必需培養(yǎng)基-α修飾(α-MEM)中擴(kuò)增，直到第4-5代。

2.2球體的形成和表征

使用懸滴技術(shù)在48小時(shí)內(nèi)形成間充質(zhì)干細(xì)胞球體，每25μm液滴含15000、30000或60000個(gè)細(xì)胞。之所以選擇這個(gè)范圍，是因?yàn)橹坝袌?bào)道稱，形成的球體大小低于或高于氧氣的擴(kuò)散極限，營(yíng)養(yǎng)因子分泌增加，同時(shí)也是為了研究文獻(xiàn)中報(bào)道的類似大小的球體。之所以選擇這種形成持續(xù)時(shí)間，是因?yàn)樗軌虺掷m(xù)形成緊密的球體。球體聚集48小時(shí)后，通過(guò)明視野顯微鏡對(duì)球體直徑進(jìn)行量化，并使用IMAGEJ進(jìn)行分析。

2.3氧分壓測(cè)量

圖1(a)氧氣微電極和間充質(zhì)干細(xì)胞球體的實(shí)驗(yàn)裝置。

在25℃的環(huán)境空氣中，使用Unisense氧氣微電極OX-10(Unisense，丹麥)測(cè)量球體內(nèi)的氧分壓，該電極的外端直徑為10μm，檢測(cè)限為0.3μM O2。用玻璃微量移液管在微弱的吸力下固定球形體，使用Eclipse TS100顯微鏡觀察微電極的放置情況。使用焦平面將微電極置于球體中部，每隔10μm測(cè)量一次氧分壓，直至球體中心。為了避免微電極與玻璃微量移液器接觸，沒(méi)有對(duì)球面的整個(gè)直徑進(jìn)行剖面測(cè)量(圖1a)。

2.4數(shù)學(xué)建模

在對(duì)相應(yīng)位置的氧分壓進(jìn)行采樣后，這些數(shù)據(jù)被用于生成數(shù)學(xué)模型。由于球體內(nèi)的間充質(zhì)干細(xì)胞在向中心擴(kuò)散的過(guò)程中會(huì)消耗氧氣，因此我們將這些數(shù)據(jù)與之前描述的同時(shí)消耗氧氣的擴(kuò)散運(yùn)輸質(zhì)量轉(zhuǎn)移方程進(jìn)行了擬合：

(2.1)

其中，C為氧氣濃度；t為時(shí)間；D為二元擴(kuò)散系數(shù)；ψ為反應(yīng)項(xiàng)，假設(shè)如下：

(i)系統(tǒng)處于穩(wěn)定狀態(tài)。

(ii)氧的變化只發(fā)生在一個(gè)維度上，即徑向坐標(biāo)r，而不取決于極角(θ)或方位角(w)。

(iii)氧氣消耗的反應(yīng)速率是零階反應(yīng)；細(xì)胞消耗氧氣的最大速率K在每個(gè)球體內(nèi)都是恒定的。

該方程可以用球面拉普拉卡矩改寫(xiě)為

(2.2)

r是徑向坐標(biāo)。

微分方程可以寫(xiě)成

(2.3)

可行的解決方案是

(2.4)

其中，R是球面半徑；C0是球面的氧氣濃度；b是dC/dr=0時(shí)的半徑，代表球面內(nèi)缺氧核心的邊界(圖1b、c)。

圖1(b)低氧核心存在/不存在的示意圖；(c)理論示意圖，說(shuō)明缺氧核心的存在/不存在對(duì)氧分壓曲線的影響。

這可以進(jìn)一步簡(jiǎn)化為

(2.5)

為了求解K/D[=]mol/(L*cm2)和b[=]μm的值，將氧氣濃度和球體內(nèi)相應(yīng)的徑向位置輸入方程(2.5)，并在MATLAB中進(jìn)行數(shù)值積分。

2.5球體尺寸和堆積密度分析

為了估算球體半徑，假定細(xì)胞組裝成球體時(shí)遵循均勻硬球緊密堆積的行為。類似大小的硬球陣列可達(dá)到的最大體積分?jǐn)?shù)為π/全等于0:74，球體內(nèi)間充質(zhì)干細(xì)胞的直徑估計(jì)為15μm，因此每個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞的體積為1767μm3。

預(yù)測(cè)球面半徑

(2.6)

堆積密度是用已知細(xì)胞數(shù)除以集合體體積計(jì)算得出的，假定為球形。

(2.7)

2.6評(píng)估細(xì)胞功能

球形形成后，用被動(dòng)裂解緩沖液裂解間充質(zhì)干細(xì)胞，使用Caspase-Glo 3/7分析法對(duì)每個(gè)樣本的100μl裂解液進(jìn)行凋亡定量測(cè)定。熒光在微孔板閱讀器上檢測(cè)，并與DNA含量歸一化，DNA含量是使用Quant-iTPicoGreen DNA檢測(cè)試劑盒從相同裂解液中測(cè)定的。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明，使用雙喹啉酸測(cè)定法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，并與DNA含量標(biāo)準(zhǔn)化。葡萄糖和乳酸的濃度由培養(yǎng)基樣本和裂解緩沖液測(cè)定，并根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明使用比色測(cè)定試劑盒進(jìn)行評(píng)估。葡萄糖消耗量的計(jì)算方法是，從生產(chǎn)商提供的5.5mM初始儲(chǔ)備培養(yǎng)基中減去剩余的葡萄糖濃度。由于α-MEM中不存在乳酸鹽，因此培養(yǎng)基中測(cè)得的所有乳酸鹽都是作為細(xì)胞呼吸的產(chǎn)物計(jì)算的。6-磷酸葡萄糖(G6P)是根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明，使用市售的酶測(cè)定法對(duì)裂解液進(jìn)行評(píng)估，并與細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行歸一化。

2.7組織學(xué)分析

間充質(zhì)干細(xì)胞球體的細(xì)胞活力是通過(guò)活-死檢測(cè)法評(píng)估的，該檢測(cè)法基于鈣黃綠素AM和碘化丙啶同時(shí)測(cè)定活細(xì)胞和死細(xì)胞。作為碘化丙啶的陽(yáng)性對(duì)照，在用鈣藍(lán)蛋白AM/碘化丙啶溶液孵育30分鐘之前，按照生產(chǎn)商的說(shuō)明將每個(gè)球形體含有60000個(gè)細(xì)胞的球形體放入70%的甲醇中孵育。為了觀察球體內(nèi)細(xì)胞凋亡早期至中期階段的凋亡區(qū)域，在由10mM 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸、140mM氯化鈉和2.5mM氯化鈣組成的緩沖液中，將與異硫氰酸熒光素(FITC)共軛的附件素V以1:20的稀釋度涂抹在切片上。在清洗和成像之前，樣品在37℃溫度下與附件素V一起孵育30分鐘。通過(guò)胰藍(lán)排除法確定的存活細(xì)胞作為附件素V染色的陰性對(duì)照，而在750nM石杉?jí)A中孵育20小時(shí)的細(xì)胞以及500000個(gè)細(xì)胞球作為陽(yáng)性對(duì)照。所有樣本均使用40,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染色。將FITC信號(hào)(annexinV)面積與藍(lán)色信號(hào)(細(xì)胞核)面積進(jìn)行歸一化處理，以確定每個(gè)球形體內(nèi)部和外圍區(qū)域的凋亡指數(shù)，從而顯示球形體內(nèi)部是否存在凋亡核心。

為了觀察球體內(nèi)的缺氧區(qū)域，在球體內(nèi)加入鹽酸咪唑(200mM)并在環(huán)境空氣中培養(yǎng)2小時(shí)。作為陽(yáng)性對(duì)照，收集前將每個(gè)球形體含有60000個(gè)細(xì)胞的球形體在1%的氧氣中培養(yǎng)5天，在此過(guò)程中也在1%的氧氣中與咪唑一起培養(yǎng)。用試劑盒中1:50稀釋的小鼠單克隆抗匹莫尼噠唑IgG對(duì)細(xì)胞進(jìn)行初級(jí)檢測(cè)，并用DAPI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行反染。

使用EclipseTE2000U顯微鏡和Andor Zyla數(shù)碼相機(jī)對(duì)球形體進(jìn)行成像。收集球狀物并用10%福爾馬林固定，用磷酸鹽緩沖生理鹽水清洗，然后包埋在HistoGel中。用Tissue-TekOCT化合物包埋樣本，在CM1850型低溫恒溫器上切割10μm的切片，然后裝入顯微鏡載玻片進(jìn)行分析。為觀察細(xì)胞形態(tài)，按上述方法收集球體并進(jìn)行冷凍切片，但收集前不進(jìn)行染色。然后用H&E染色切片并成像。