培養

為驗證田間研究并調查AOA和AOB響應銨底物添加的動態變化，用0.16 mM NH4Cl溶液培養在田間研究中觀察到AOA開始占主導地位的40-50厘米層的施用糞肥土壤樣本。為了比較，還引入了來自40-50厘米層的未施用土壤樣本。培養在黑暗條件下厭氧進行5周。每周測量溶液中NH4Cl的濃度。在第一周、第三周和第五周定量沉積物中古菌和細菌amoA基因的拷貝數。

DNA分離

使用MoBio Ultra-Clean土壤DNA分離試劑盒（MoBio,USA）從0.25克土壤中提取DNA，根據制造商說明進行輕微修改：將珠子管放在MoBio Vortex Adapter管架（MoBio目錄號13000-V1）上，以最大速度渦旋5分鐘代替10分鐘。之后，將管子在水浴中70°C加熱另外5分鐘以促進細胞破碎。用50μl無菌MilliQ過濾水洗脫DNA，并儲存在-20°C。

定量PCR

定量PCR使用ABI Prism 7300序列檢測系統（Applied Biosystems,USA）進行，步驟如下：50°C 2分鐘，95°C 30秒，然后進行40個循環：95°C 10秒，AOA為53°C或AOB為55°C 30秒，72°C 1分鐘。25μl反應體積包含12.5μl SYBR Premix Ex Taq（TAKARA,Dalian,China），200 nmol L-1的引物和2μl十倍稀釋的DNA作為模板。每個樣本分析三個重復。

從含有細菌或古菌amoA基因的陽性克隆中分離的質粒DNA用作定量PCR的標準曲線。質粒DNA濃度在Nanodrop ND-1000紫外-可見分光光度計（NanoDrop Technologies,USA）上測定，amoA基因的拷貝數直接從濃度計算。將已知拷貝數的質粒DNA的十倍系列稀釋液進行定量PCR，三次重復，以生成外部標準曲線。使用擴增效率和相關系數約為95%和0.95的結果。通過熔解曲線分析檢查amoA基因的特異性擴增，結果顯示單一峰。

統計分析

使用SPSS 13.0版進行配對樣本t檢驗，以檢驗古菌和細菌amoA基因拷貝數之間差異的顯著性。為找出影響amoA基因豐度的關鍵環境參數，使用基于Bray-Curtis距離矩陣的相關性分析和主成分分析（PCA）來提取環境參數的最重要信息。PCA在程序R中使用vegan包進行，PCA提取與AOA和AOB豐度之間的相關性在PAST中進行。在分析之前，對古菌和細菌amoA基因的拷貝數進行log10轉換以使其分布正態化。

結果

土壤性質

測量了每10厘米深度處銨態氮（NH4+-N）、亞硝酸鹽加硝酸鹽氮（NOx--N）、TN、總有機質（TOM）、pH和氧氣（DO）的垂直剖面（圖1）。

在施用糞肥的土壤中，表層（0-10厘米）的NH4+-N為137.1 mg kg-1，并在10-20厘米深度達到峰值178.8 mg kg-1。NOx--N、TN和TOM的最高濃度在表層觀察到，分別為60.8 mg kg-1、3.9 g kg-1和44.5 g kg-1。pH范圍從6.69（0-10厘米）到7.05（90-100厘米）。氧氣在10厘米以下迅速下降到檢測限以下，因此成為好氧氨氧化的限制因素。此外，NH4+-N、NOx--N、TN和TOM的比例表明土壤中有機氮占很大比例。

在未施用土壤中觀察到類似的變化，但每個參數的濃度要低得多。表層土壤（0-10厘米）的NH4+-N低于地下層（10-20厘米），并在10-20厘米深度達到峰值20.1 mg kg-1。NOx--N、TN和TOM的濃度在表層達到峰值，分別為9.1 mg kg-1、0.9 g kg-1和9.8 g kg-1。pH在深層土壤中略有增加，范圍從6.65（0-10厘米）到8.19（90-100厘米）。

長期糞肥施用對amoA基因豐度的影響

古菌amoA基因存在于施用糞肥和未施用土壤巖心的每一層。拷貝數范圍從1.2 x 10^6到1.3 x 10^7 g-1干土重，并且平均而言，上層（0-30厘米）的拷貝數遠高于深層（70-100厘米）（圖2）。施用糞肥土壤中的最高拷貝數在20-30厘米深度層觀察到，為4.8 x 10^7 g-1干土重。然而，它仍然低于未施用土壤相同深度的1.2 x 10^8 g-1干土重。在其他層也觀察到相同趨勢，即未施用土壤中古菌amoA基因的拷貝數略高，但不顯著（p>0.05）。因此，得出結論，糞肥施用對AOA種群沒有顯著的刺激作用。

糞肥施用的刺激作用對AOB種群似乎是明顯的。施用糞肥土壤中細菌amoA基因的拷貝數范圍從8.8 x 10^6到3.2 x 10^8 g-1干土重，顯著高于未施用土壤的范圍（從1.6 x 10^4到6.3 x 10^6 g-1干土重）（p<0.05）。細菌amoA基因在未施用土壤中只能在50厘米以上的層檢測到，但在施用糞肥土壤中在70厘米處更深。此外，在施用糞肥土壤中，圍繞耕作層和犁底層（0-30厘米）的層中的AOB比其古菌對應物更占優勢。由于細菌amoA基因拷貝數的迅速減少，AOA在深層（40-100厘米）更占優勢。相比之下，在沒有糞肥施用的土壤樣本的所有深度中，氨氧化微生物以AOA為主。

糞肥施用對土壤硝化的影響也通過PNRs的變化反映出來。在施用糞肥土壤中檢測到的PNRs（14-218 nmol L-1 N g-1 h-1）顯著高于（p<0.05）未施用土壤的PNRs（5-72 nmol L-1 N g-1 h-1），最高值出現在表層（0-10厘米）。PNRs迅速下降直到犁底層（20-30厘米），并在施用糞肥和未施用土壤巖心的深層（60-100厘米）分別維持在14-23和5-14 nmol L-1 N g-1 h-1之間，變化較小。此外，注意到PNRs的變化與細菌amoA基因拷貝數的變化一致。