摘要

糞肥在農(nóng)業(yè)中被廣泛使用，并高度影響了土壤微生物群落，例如氨氧化微生物。然而，關(guān)于受糞肥施用影響的稻田土壤中古菌與細(xì)菌氨氧化微生物群落的認(rèn)知仍然很大程度上未知，尤其是長(zhǎng)期影響。在本工作中，通過(guò)研究?jī)蓚€(gè)復(fù)合土壤巖心（長(zhǎng)期施用糞肥與未擾動(dòng)對(duì)照），調(diào)查了糞肥施用對(duì)氨氧化微生物種群、相關(guān)潛在硝化速率（PNRs）以及控制該影響的關(guān)鍵因素的影響。此外，設(shè)計(jì)了用NH4+培養(yǎng)5周的土壤實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證田間研究。結(jié)果表明，施用糞肥土壤中細(xì)菌amoA基因的拷貝數(shù)顯著高于未施用土壤（p<0.05），表明長(zhǎng)期糞肥施用對(duì)氨氧化細(xì)菌（AOB）的種群具有明顯的刺激作用。在施用糞肥的土壤巖心中檢測(cè)到的PNRs（14-218 nmol L-1 N g-1 h-1）顯著高于未施用土壤巖心（5-72 nmol L-1 N g-1 h-1；p<0.05）。觀察到PNRs與細(xì)菌amoA基因拷貝數(shù)而非古菌amoA基因拷貝數(shù)高度相關(guān)，表明與細(xì)菌氨氧化微生物相關(guān)的強(qiáng)硝化能力。NH4+-N與AOB的豐度顯著相關(guān)（p<0.01）并解釋了96.1%的環(huán)境變異，表明NH4+-N是影響AOB種群的主要因素。培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明，兩種土壤中細(xì)菌amoA基因豐度明顯增加（從2.0 x 10^6到8.4 x 10^6 g-1干土重和從1.6 x 10^4到4.8 x 10^5 g-1干土重），而古菌amoA基因則未增加，這與田間觀察結(jié)果一致。總之，我們的結(jié)果表明，無(wú)論是長(zhǎng)期還是短期使用，糞肥施用促進(jìn)了細(xì)菌氨氧化微生物的種群規(guī)模，而非其古菌對(duì)應(yīng)物，且NH4+-N是關(guān)鍵影響因素。

引言

過(guò)去幾十年，基于銨的氮肥施用顯著提高了水稻產(chǎn)量。然而，只有27-33%的施用的氮肥能在植物材料中被回收。在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，硝化作用作為耦合的硝化-反硝化作用的第一步，是氮肥損失的關(guān)鍵步驟。硝化作用，即NH3轉(zhuǎn)化為羥胺，由具有關(guān)鍵氨單加氧酶（AMO）的氨氧化古菌（AOA）和氨氧化細(xì)菌（AOB）完成。AOA和AOB獨(dú)特的生理學(xué)和代謝表明，環(huán)境因素如pH、有機(jī)碳、NH4+可用性和鹽度可能決定這兩個(gè)類(lèi)群在自然生態(tài)系統(tǒng)中的分布和功能重要性。基于培養(yǎng)的研究和針對(duì)編碼AMO催化亞基A的amoA基因的分子調(diào)查已被廣泛用于研究施肥對(duì)氨氧化微生物的影響。隸屬于奇古菌門(mén)（Thaumarchaeota）內(nèi)一個(gè)新分支的AOA在各種土壤中在數(shù)量上超過(guò)了其細(xì)菌對(duì)應(yīng)物。然而，關(guān)于受糞肥施用影響的稻田土壤中古菌與細(xì)菌氨氧化微生物群落的認(rèn)知仍然知之甚少，尤其是長(zhǎng)期影響。

在稻田中，化學(xué)和有機(jī)肥料的強(qiáng)化施用為原位條件下AOA和AOB的生長(zhǎng)提供了充足的底物。此外，沿深度在稻田土壤中形成的垂直銨通量/濃度和氧化還原梯度高度影響了微生境中細(xì)菌、真菌和古菌（包括AOA）的結(jié)構(gòu)和功能。這些垂直剖面的變化為研究變化的環(huán)境對(duì)稻田土壤中氨氧化微生物群落的影響提供了一個(gè)便利的系統(tǒng)。

本研究旨在調(diào)查稻田土壤中AOA和AOB種群的垂直剖面及其對(duì)糞肥施用的響應(yīng)。為實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)，從一個(gè)長(zhǎng)期施用糞肥的稻田和一個(gè)相鄰未施肥且未種植水稻的地點(diǎn)采集了巖心樣本。然后進(jìn)行了為期5周的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證田間研究并調(diào)查AOA和AOB響應(yīng)銨底物添加的動(dòng)態(tài)變化。通過(guò)針對(duì)amoA基因的定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）測(cè)定了AOA和AOB的豐度。同時(shí)測(cè)量了土壤性質(zhì)和PNRs。將土壤化學(xué)性質(zhì)與AOA和AOB豐度之間的關(guān)系進(jìn)行相關(guān)性分析，以找出控制其種群大小的關(guān)鍵因素以及AOA和AOB在稻田土壤硝化作用中的推定貢獻(xiàn)。

材料與方法

采樣地點(diǎn)與采樣

樣本取自中國(guó)南方浙江省嘉興市一個(gè)典型水稻種植區(qū)的稻田。在一個(gè)水稻-小麥輪作系統(tǒng)中，糞肥施用（生長(zhǎng)季節(jié)的4月至每月兩次）已持續(xù)20多年。糞肥主要由牲畜廢物（包括尿液、糞便和沖洗水）構(gòu)成，這些廢物主要在鄰近農(nóng)場(chǎng)發(fā)酵，并通過(guò)兩個(gè)渠道輸入稻田。糞肥含有高銨態(tài)氮（NH4+-N）和化學(xué)需氧量（COD；表1）。其中，銨占全氮（TN）含量的49-60%。選擇一個(gè)相鄰未受糞肥影響且未種植水稻的地塊作為對(duì)照。土壤樣本于2009年11月收獲后（無(wú)水淹條件下）從0-100厘米深度采集。從每個(gè)地塊取三個(gè)土壤巖心（直徑約5厘米），將同一深度（每10厘米間隔）的樣本混合形成一個(gè)復(fù)合樣本。樣本在運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室時(shí)密封在無(wú)菌塑料袋中并置于冰上。一部分在4°C儲(chǔ)存用于培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，另一部分通過(guò)2.0毫米篩用于土壤特性分析。其余部分在-80°C儲(chǔ)存用于DNA提取和下游分析。

化學(xué)性質(zhì)與潛在硝化速率測(cè)量

土壤中的銨、亞硝酸鹽和硝酸鹽用2 M KCl提取緩沖液提取，并通過(guò)連續(xù)流動(dòng)分析儀（Skalar+Analytical,The Netherlands）測(cè)量。土壤pH用土水比1:2.5測(cè)定，并用PB-10 pH計(jì)（Sartorius,Germany）測(cè)量。土壤有機(jī)質(zhì)（TOM）和TN根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定。每個(gè)測(cè)量進(jìn)行三次重復(fù)。新鮮土壤中的氧氣濃度使用OXY Meter S/N 4164不銹鋼電極傳感器（Unisense,Denmark）原位測(cè)量。潛在硝化速率的測(cè)量根據(jù)先前報(bào)告使用氯酸鹽抑制法進(jìn)行。簡(jiǎn)而言之，將5.0克土壤加入含有20毫升磷酸鹽緩沖溶液（PBS;g/L:NaCl,8.0;KCl,0.2;Na2HPO4,0.2;NaH2PO4,0.2;pH 7.4）和1 mM(NH4)2SO4的50毫升離心管中。加入終濃度為10 mM的氯酸鉀以抑制亞硝酸鹽氧化。懸浮液在25°C的黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。亞硝酸鹽用5毫升2 M KCl溶液提取，并通過(guò)分光光度計(jì)在540 nm波長(zhǎng)下用N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽測(cè)定。表觀潛在硝化速率根據(jù)前6小時(shí)內(nèi)NO2-N濃度的線性增加計(jì)算。