摘要

鉀離子（K?）廣泛參與多種生理病理過程，其異常變化與腦缺血等腦部疾病的發(fā)生密切相關(guān)。在體內(nèi)獲取K?的變化對(duì)于理解K?在大腦功能中發(fā)揮的作用具有重要意義。本研究開發(fā)了一種基于單鏈DNA適配體的微電極，用于高選擇性檢測腦內(nèi)K?。該適配體探針設(shè)計(jì)包含三個(gè)部分：用于特異性識(shí)別K?的適配體序列、用于穩(wěn)定固定探針于金表面的末端炔基，以及作為電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)的二茂鐵氧化還原活性基團(tuán)。通過改變適配體探針的鏈長度，可合理調(diào)節(jié)微電極的響應(yīng)范圍。優(yōu)化后的電極LAC具備高選擇性，線性范圍為10μmol·L?1至10 mmol·L?1，滿足腦內(nèi)K?檢測需求。最終，該微電極成功應(yīng)用于缺氧條件下活體小鼠腦中K?的檢測。

1.引言

作為細(xì)胞內(nèi)液的主要陽離子，鉀離子（K?）廣泛參與神經(jīng)信號(hào)傳遞及腦內(nèi)氧化還原等生理病理過程。K?濃度的異常變化可能與多種腦疾病（如腦缺血和腦出血）密切相關(guān)。目前，K?的檢測方法包括原子吸收光譜、原子發(fā)射光譜、熒光光譜等，但這些方法難以實(shí)現(xiàn)腦內(nèi)K?的活體檢測?；诳芍踩胛㈦姌O的電化學(xué)方法因具有高時(shí)空分辨率的特點(diǎn)，被廣泛用于體內(nèi)離子監(jiān)測。然而，K?的外部電子結(jié)構(gòu)與鈉離子（Na?）相似，且細(xì)胞外Na?濃度是K?的30-50倍，因此在活體動(dòng)物中高選擇性識(shí)別與檢測K?仍面臨巨大挑戰(zhàn)（見Scheme 1）。

適配體是單鏈寡核苷酸分子，可通過體外篩選高選擇性結(jié)合多種目標(biāo)分析物（包括離子、小分子、蛋白質(zhì)、肽段乃至整個(gè)細(xì)胞）。通過適配體與離子結(jié)合后觸發(fā)空間折疊，并基于電化學(xué)響應(yīng)元件與電極表面距離變化引起的信號(hào)變化，已成功實(shí)現(xiàn)K?的選擇性檢測。然而，已開發(fā)的基于適配體的電化學(xué)離子傳感器線性范圍通常為nmol·L?1至μmol·L?1，無法滿足活體大鼠腦中K?濃度（約mmol·L?1）的檢測需求。因此，如何調(diào)節(jié)適配體電極的響應(yīng)范圍以適應(yīng)體內(nèi)應(yīng)用仍具挑戰(zhàn)性。

為應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)，本研究設(shè)計(jì)并制備了一種線性范圍可控的適配體修飾微電極，通過合理調(diào)節(jié)響應(yīng)距離實(shí)現(xiàn)活體腦中K?的實(shí)時(shí)檢測。適配體序列TTTGGTTGGTGTGGTTGGTTT用于特異性識(shí)別K?，其5′末端修飾二茂鐵（Fc）作為電化學(xué)氧化還原基團(tuán)，3′末端修飾炔基以穩(wěn)定固定于金顆粒修飾的碳纖維電極表面。識(shí)別并捕獲K?后，適配體發(fā)生空間折疊，使Fc基團(tuán)更接近電極表面，從而增加法拉第電流響應(yīng)。另一方面，通過設(shè)計(jì)不同鏈長的適配體變體，調(diào)節(jié)K?結(jié)合后Fc與電極表面的距離，有效改變了微電極的線性范圍，使其適用于腦內(nèi)活體檢測（Scheme 1）。最終，基于可調(diào)諧電化學(xué)傳感器，我們成功實(shí)現(xiàn)了缺氧條件下小鼠腦中K?的測量。

2.實(shí)驗(yàn)部分

2.1.化學(xué)品與試劑

碳纖維購自Tokai Carbon公司（日本Tokai）。AuCl?·HCl·4H?O、K?[Fe(CN)?]、NaCl、CaCl?、KCl、MgCl?·6H?O、CuCl?·2H?O、FeCl?·6H?O、ZnCl?、AlCl?·6H?O、抗壞血酸（AA）、多巴胺（DA）、尿酸（UA）、半胱氨酸（Cys）、谷氨酰胺（Gln）、組氨酸（His）和精氨酸（Arg）購自阿拉丁化學(xué)有限公司（中國上海）。人工腦脊液（aCSF）粉末購自Adamas-Beta（中國上海）。C≡C-H和二茂鐵（Fc）雙修飾適配體由上海DNA生物科技有限公司合成。序列選擇如下：

?SAC：Fc-5′-TTTGGTTGGTGTGGTTGGTTT-3′-C≡C-H

?MAC：Fc-5′-TTTGGTTGGTGTGGTTGGTTTTTTTTTTTTT-3′-C≡C-H

?LAC：Fc-5′-TTTGGTTGGTGTGGTTGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′-C≡C-H

2.2.微電極制備

碳纖維微電極（CFME）按先前方法制備，使用前浸泡于丙酮中清潔表面。隨后，在0.1 mol·L?1HAuCl?溶液中于-0.2 V（vs.Ag/AgCl）電沉積10 s，在金微片表面修飾CFME。電極用水沖洗去除附著溶液后，在N?氣氛下干燥6 h。

2.3.適配體在電極表面的固定

將C≡C-H和Fc雙修飾適配體配制成100μmol·L?1水溶液，通N?除去溶解氧。將制備的AuS/CFME浸入適配體溶液中，于60°C反應(yīng)6 h以固定適配體。

2.4.活體小鼠腦缺氧實(shí)驗(yàn)

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵循中國科學(xué)技術(shù)部《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》，并經(jīng)華東師范大學(xué)動(dòng)物護(hù)理與使用委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：m+R20190304，中國上海）。為檢測活體小鼠海馬區(qū)K?，C57BL/6小鼠用2%異氟烷麻醉后固定于腦立體定位儀，剪開頭皮清除結(jié)締組織。以前囟為參考點(diǎn)（AP=-1.30 mm,L=0.75 mm,V=1.25 mm）鉆孔，將微電極小心植入腦內(nèi)。缺氧實(shí)驗(yàn)通過將小鼠置于通有混合氣體（5%O?和95%N?）的自制氣密箱中進(jìn)行。