3.2.pH對N2O積累的影響

通過批式測試2研究的pH對作為硝酸鹽還原中間產物的N2O積累的影響顯示于圖4。由于初始COD與NO??-N比為1.5:1，甲醇量不足以完全去除硝酸鹽。因此，在所有實驗中觀察到兩個不同的還原階段：存在甲醇作為外源碳源時的反硝化（0至約100分鐘），其中硝酸鹽以較高速率還原；和無外源碳源時的反硝化（內源反硝化）（100–300分鐘），其中硝酸鹽以低得多速率還原。

在pH 6.0（圖4a），兩個階段均出現N2O積累，第一階段中20%的去除硝酸鹽以N2O形式積累，內源反硝化期間40%的去除硝酸鹽以N?O形式積累。在pH 6.5（圖4b）；盡管第一階段無N2O積累，但在內源階段開始積累。約30%的內源反硝化期間去除的硝酸鹽以N?O形式積累。相反，在pH 7.0（圖4c）兩個階段均無N2O積累，在較高pH范圍研究中也得到類似結果。所有測試中亞硝酸鹽濃度低于2.0mg N/L，未觀察到顯著亞硝酸鹽積累。

圖4還顯示了在三種pH條件下模型預測與測量的硝酸鹽和N2O曲線之間的擬合。雖然所有情況下硝酸鹽曲線均得到合理預測（特別是考慮到未進行參數優化），但ASMN模型未能重現pH 6.0和6.5下觀察到的N?O積累。

圖5顯示了母SBR在pH 6.0和pH 7.2下一個典型周期內的NO??和N?O曲線。兩種pH條件下進料期間硝酸鹽均積累。在pH 7.2時未檢測到N2O積累。在pH 6.0時，一旦進料期開始即出現N2O積累，這與批式測試2在pH 6.0下的結果一致。然而，積累的N?O可在缺氧階段后期、硝酸鹽完全去除后被消耗。

4.討論

4.1.N2O還原動力學的pH依賴性

盡管低pH被認為是導致反硝化中硝酸鹽或亞硝酸鹽還原過程中N2O作為中間產物積累的重要影響因素（Kampschreur et al.,2009），但其對N2O還原的直接效應尚不清楚。本研究通過直接將N2O儲備液加入富集的甲醇利用型菌群，rigorous研究了pH對最大N2O還原速率k_{m,N_2O}和半飽和系數K_{S,N_2O}的影響。

如圖3a所示，N2O還原酶的半飽和系數表現出對pH水平的強烈依賴性。K_{S,N_2O}值隨pH從9.0降至6.0而減小，表明N2O還原酶在低pH條件下對其底物N2O具有更高親和力。理論計算表明，在低pH條件下破壞N2O分子N-O鍵所需的活化能降低（Gorelsky et al.,2005）。因此，分子N2O的活化及與Nos的結合在低pH下能量上更容易，這可能導致酸性條件下更高的底物親和力（更低的K_{S,N_2O}）。

本研究獲得的K_{S,N_2O}值（范圍0.10–0.92mg N?O-N/L，圖3a）顯著高于Vonschulthess et al.（1994）和Schonharting et al.（1998）報道的值（分別為0.0052mg/L和0.0015mg/L）。這可能由于使用了不同菌群（甲醇利用型與乙酸利用型反硝化菌）。然而，參數估計方法的不同也可能contributed to the difference。本研究中，K_{S,N_2O}和k_{m,N_2O}值通過將N2O還原數據與N2O還原動力學模型（方程1）擬合直接估計。比較之下，在Vonschulthess et al.（1994）和Schonharting et al.（1998）中，參數通過N2O作為硝酸鹽或亞硝酸鹽還原中間產物時估計。后者方法難以準確估計N2O還原動力學。Zumft（1997）回顧了多項純菌研究中測量的K_{S,N_2O}值，范圍從0.03mg N?O-N/L至0.36mg N?O-N/L。這些值大多在環境pH控制在中性時測量。本研究中，pH 7.0時估計的K_{S,N_2O}值為0.4mg N?O-N/L，與Zumft（1997）報道的高K_{S,N_2O}值相當。

4.2.低pH條件下N2O積累的機制

由于N2O是硝酸鹽還原的下游產物，一個直接的假設可能是：在低pH下，N2O還原速率無法跟上硝酸鹽還原速率，從而導致N2O積累。然而，本研究的實驗結果表明情況并非如此?；诒狙芯看_定的各pH水平下的k_{m,NO_3}、k_{m,N_2O}和K_{S,N_2O}值，可以計算出每個pH水平下，為使N2O還原速率跟上硝酸鹽還原速率所需的N2O濃度。這是通過將k_{m,NO_3}值應用于方程（1）的左側，并將k_{m,N_2O}、K_{S,N_2O}值應用于方程（1）的右側來實現的。結果表明，在所有pH水平下，滿足最大硝酸鹽還原速率所需的N2O濃度均可忽略不計（<0.12 mg N?O-N/L）。例如，在pH 6.0時，計算出的N2O濃度僅為0.04 mg N?O-N/L，遠低于觀察到的N2O積累水平（8 mg N?O-N/L，圖4a）。這些發現表明，低pH條件下的N2O積累現象并非，或至少不完全是，由于N2O還原酶還原能力的降低。

在pH 6.5下觀察到的現象，即反應一旦進入內源期（約100分鐘時）N2O便開始積累（圖4b），表明電子供體的可用性可能在N2O積累中扮演了重要角色。由于碳氧化速率在內源期顯著減慢，不同氮物種還原之間很可能發生電子競爭（Ku?era et al.,1983）。各種氮物種還原酶競爭有限電子的相對能力，可能決定了哪種氮物種被還原以及哪種會積累（Almeida et al.,1995）。電子競爭也可能在碳源過量時發生。反硝化涉及碳氧化以供應電子和氮氧化物還原以消耗電子。每當電子供應速率不能滿足所有還原酶的總電子接受能力時，不同氮氧化物還原酶之間就會發生電子競爭。

我們的結果表明，pH不僅影響氮氧化物還原酶的活性（圖2），還影響碳氧化速率。例如，從圖4可以估算出，在pH 6.0、6.5和7.0時，甲醇消耗速率分別約為170、200和210 mg COD/(gVSS·小時)。我們假設，在pH 6.0且有甲醇存在時觀察到的N2O積累（圖4a）可能與碳氧化速率降低導致電子供應速率減少，進而加劇不同氮氧化物還原酶之間對電子的競爭有關。與較高pH下的比值相比，在pH 6.0時，N2O還原酶活性與硝酸鹽和亞硝酸鹽還原酶活性的比值相對較低（圖2），這意味著在酸性條件下，與硝酸鹽和亞硝酸鹽還原酶相比，N2O還原酶的活性較低。這一點，再加上碳氧化速率的降低，意味著N2O在更強酸性條件下（pH 6.0和6.5）比在中性或相對堿性條件下（pH 7.0至9.0）更可能積累。Schalk-Otte等人（2000）通過研究糞產堿桿菌（Alcaligenes faecalis）在“豐盛-饑餓”喂養制度下的行為，觀察到一旦外源碳化合物耗盡，培養物進入饑餓狀態并開始消耗內部儲存化合物時，就會有大量N2O積累。然而，目前對不同反硝化酶之間電子競爭的機制仍不甚了解。需要進一步的研究來獲得深入的理解。

4.3.對污水處理廠運行和反硝化建模的啟示

本研究表明，在低pH條件下，污水處理反應器反硝化過程中N2O可積累至2.0 mg N?O-N/L以上（圖5），如果這些N2O在后續的好氧階段被剝離，將導致大量的N2O排放。在反硝化過程中避免低pH將有利于減少N2O排放。如果N2O積累確實發生在污水處理廠中，當有足夠COD進行完全反硝化時，延長缺氧時間可能有助于減少積累的N2O，如圖5所示。否則，可能需要添加外源COD來去除積累的N2O。

在污水處理廠中，當廢水中有機碳含量不足時，通常需要添加外源碳源以達到較低的出水硝酸鹽濃度（Ginige et al.,2009）。然而，不同的碳源可能對N2O積累產生不同的影響（Adouani et al.,2009;Lu and Chandran,2010）。本研究證明，當使用甲醇作為外源碳源時，N2O還原速率遠高于硝酸鹽還原速率，而當使用乙酸作為碳源時，情況并非如此（Vonschulthess et al.,1994;Schonharting et al.,1998）。因此，使用甲醇作為外源碳源有可能降低反硝化過程中N2O積累的風險。

由于氧化亞氮通常在污水處理廠中不被測量，模型將是預測N2O排放的有用工具。目前，Hiatt和Grady（2008）的ASMN模型已被接受用于預測反硝化過程中的N2O產生和積累。然而，如圖4所示，該模型未能預測在pH 6.0和6.5下測量到的N2O積累。在4步ASMN模型中，所有反硝化步驟都被建模為獨立的過程，其反應速率由電子供體和相應電子受體的濃度決定。換句話說，該模型沒有考慮當電子供應不能滿足所有這些酶的電子需求時，不同酶之間可能發生的電子競爭。不同氮氧化物還原酶之間的電子競爭過程應被納入四步反硝化模型，以便正確模擬N2O積累，特別是在碳氧化提供的電子供應受限的情況下，例如內源期。在開發此類模型之前，需要更多的研究來理解不同氮物種還原酶之間的電子競爭。在此之前，在解釋ASMN模型的N2O預測時，應考慮其在電子競爭方面的局限性。

5.結論

系統研究了pH對甲醇利用型反硝化菌群反硝化過程中N2O還原動力學和N2O積累的影響。主要結論如下：

?最大特異性N2O還原速率和N2O還原酶對N2O的親和力均強烈依賴于pH。在pH 6.0-6.5范圍內，這兩個動力學參數均顯著低于最適范圍（7.5-8.0）。

?在研究pH范圍（6.0-9.0）內，最大特異性N2O還原速率始終顯著（4-9倍）高于相應的最大特異性硝酸鹽和亞硝酸鹽還原速率。雖然最大特異性硝酸鹽和亞硝酸鹽還原速率也隨pH變化，但N2O還原對pH的變化要敏感得多。

?在低pH水平（6.0-6.5）下，反硝化過程中觀察到顯著的N2O積累，這很可能是由于碳氧化提供的電子供應受限時，四個反硝化步驟之間發生電子競爭所致。