據(jù)報(bào)道，姜黃素主要通過(guò)抑制炎癥的主要調(diào)節(jié)因子--核因子κB(NFκB)來(lái)降低細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制炎癥、腫瘤生長(zhǎng)、血管生成和轉(zhuǎn)移。最近的報(bào)道還表明，姜黃素具有潛在的代謝效應(yīng)，因此我們分析了姜黃素是否以及如何影響腫瘤細(xì)胞的能量代謝。我們的研究表明，姜黃素(10μM)可抑制離體線粒體膜中ATP合酶的活性，導(dǎo)致ATP急劇下降，并減少體外和體內(nèi)腫瘤模型的耗氧量。姜黃素對(duì)ATP合成酶的影響與抑制NFκB無(wú)關(guān)，因?yàn)镮κB激酶抑制劑SC-514不會(huì)影響ATP合成酶。糖酵解酶己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶的活性只受到細(xì)胞類(lèi)型特異性的輕微影響。能量受損會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞活力下降。此外，姜黃素通過(guò)促進(jìn)活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)(脂質(zhì)氧化的標(biāo)志物)的生成以及自噬誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，至少部分原因是激活了AMP激活蛋白激酶(AMPK)。根據(jù)體外抗腫瘤效果，姜黃素(30毫克/千克體重)可顯著延緩體內(nèi)癌癥的生長(zhǎng)，這可能是由于能量受損，也可能是通過(guò)減少腫瘤血管生成。這些結(jié)果證明，細(xì)胞能量代謝的核心酶ATP合酶是抗腫瘤多酚的靶點(diǎn)，它能抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，并全面重塑腫瘤代謝。

引言

姜黃素(diferuloylmethane；(1E,6E)-1,7-雙(4-羥基-3-甲氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二酮)是從姜科植物姜黃中分離出來(lái)的一種多酚。它被用作香料，是咖喱的基本黃色成分。近年來(lái)，盡管姜黃素生物利用度低、吸收差、新陳代謝快、全身消除快，而且姜黃素治療患者的血液中檢測(cè)到的姜黃素含量很低，但許多研究都報(bào)告了姜黃素的抗腫瘤活性，甚至通過(guò)飲食給藥治療實(shí)體癌。據(jù)報(bào)道，姜黃素及其衍生物和類(lèi)似物可通過(guò)影響多種細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑發(fā)揮作用，但這種多酚的主要活性是抑制IκB激酶(IkK)，使核因子κB抑制劑(IκB)穩(wěn)定在去磷酸化狀態(tài)，并以非活性形式將NFκB封閉在細(xì)胞質(zhì)中。最近的研究還揭示了它作為新陳代謝調(diào)節(jié)劑的潛力，這種活性與減少炎癥和抑制NFκB有關(guān)。然而，人們很少關(guān)注姜黃素和其他多酚對(duì)癌細(xì)胞能量代謝的最終影響。

腫瘤的生長(zhǎng)需要增加核苷酸、氨基酸和脂質(zhì)等細(xì)胞構(gòu)件的合成。因此，腫瘤細(xì)胞的新陳代謝具有增殖細(xì)胞的典型特征，必須滿(mǎn)足三個(gè)新陳代謝需求：(i)生物能，(ii)大分子生物合成和(iii)氧化還原維持。因此，癌細(xì)胞新陳代謝的特點(diǎn)是對(duì)葡萄糖的攝取量增加，而葡萄糖通過(guò)有氧糖酵解(沃伯格效應(yīng))優(yōu)先代謝為乳酸，盡管與氧化磷酸化相比，這一過(guò)程產(chǎn)生ATP的效率較低。然而，由于葡萄糖優(yōu)先分解為乳酸，腫瘤細(xì)胞可將各種糖酵解中間產(chǎn)物分流到支持增殖的合成代謝途徑中。短期饑餓和禁食模擬飲食可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的沃伯格效應(yīng)，導(dǎo)致其凋亡，使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療敏感，并增強(qiáng)抗腫瘤免疫監(jiān)視，從而保護(hù)正常細(xì)胞功能。有趣的是，姜黃素和綠茶提取物表沒(méi)食子兒茶素-3-棓酸鹽等多酚類(lèi)物質(zhì)似乎也能觸發(fā)通常由長(zhǎng)期熱量限制或短期饑餓引起的分子通路。因此，如果姜黃素有可能模擬禁食的這些作用，那么它有望對(duì)腫瘤代謝產(chǎn)生重大影響。雖然尚未進(jìn)行系統(tǒng)的臨床研究，但多酚類(lèi)化合物抵制代謝綜合征發(fā)展的潛力已經(jīng)得到證實(shí)。

姜黃素通過(guò)誘導(dǎo)AMP激活激酶(AMPK)降低血糖水平，并阻斷腫瘤壞死因子α(TNFα)誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞糖酵解。后一種作用是通過(guò)姜黃素的抗炎和抗NFκB活性發(fā)揮的。Bayet-Robert及其同事對(duì)姜黃素處理過(guò)的乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行了代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽和脂質(zhì)代謝以及葡萄糖利用是多酚的主要作用靶點(diǎn)。谷胱甘肽的生物合成隨著姜黃素誘導(dǎo)的活性氧(ROS)的增加而上調(diào)。對(duì)脂質(zhì)代謝的活性可能與化合物對(duì)NFκB通路的影響有關(guān)。姜黃素和其他多酚可能通過(guò)產(chǎn)生ROS來(lái)影響線粒體的功能，但人們很少關(guān)注這些化合物對(duì)線粒體能量代謝的影響。包括姜黃素在內(nèi)的幾種多酚對(duì)正常組織線粒體ATP合成酶活性的抑制作用已被證實(shí)，但其效果取決于組織。姜黃素對(duì)細(xì)菌ATP合成酶的抑制遵循一種獨(dú)特的機(jī)制，涉及F1分子的旋轉(zhuǎn)周期。因此，姜黃素極有可能對(duì)真核生物ATP合酶產(chǎn)生類(lèi)似作用，對(duì)細(xì)胞能量代謝產(chǎn)生重大影響。

我們通過(guò)分析姜黃素對(duì)癌細(xì)胞能量代謝的影響來(lái)解決這一問(wèn)題。我們發(fā)現(xiàn)姜黃素能抑制ATP合成酶的活性，從而影響ATP/AMP比率和耗氧量，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞活力降低、ROS生成增加、細(xì)胞凋亡和自噬。姜黃素對(duì)ATP合成酶的抑制作用在體內(nèi)持續(xù)存在，并伴隨著腫瘤血管生成的減少，從而導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)的降低。姜黃素對(duì)ATP合成酶的影響與NFκB無(wú)關(guān)。

材料與方法

化學(xué)物質(zhì)

姜黃素溶解在二甲基亞砜(DMSO)中，最終濃度為100 mM，在使用前儲(chǔ)存在-20°C下。在體外實(shí)驗(yàn)中，使用前立即將其稀釋在完全培養(yǎng)基中。活性濃度是在B16細(xì)胞的初步體外實(shí)驗(yàn)中確定的。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，按照Pisano等人描述的方案，將劑量提高到30毫克/千克體重。姜黃素被稀釋在含1.65毫克/毫升牛血清白蛋白的無(wú)菌0.9%(w/v)氯化鈉溶液中。姜黃素稀釋液在注射前立即新鮮配制并避光保存。

細(xì)胞系和培養(yǎng)條件

L1210小鼠淋巴細(xì)胞白血病、4T1小鼠乳腺癌、B16小鼠黑色素瘤和CT26小鼠結(jié)腸腫瘤細(xì)胞系于2016年3月16日購(gòu)自ATCC，并在意大利細(xì)胞系中心通過(guò)微衛(wèi)星分析進(jìn)行了鑒定。所有腫瘤細(xì)胞系均在添加了1%L-谷氨酰胺、1%青霉素/鏈霉素和10%胎牛血清(完全培養(yǎng)基)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

細(xì)胞活力、凋亡和自噬的評(píng)估

在完全培養(yǎng)基中將腫瘤細(xì)胞株培養(yǎng)在12孔板中(CT26和4T1每孔1×105個(gè)，B16每孔3×104個(gè)，L1210每孔2×105個(gè))。24小時(shí)后，用10μM的姜黃素處理細(xì)胞24小時(shí)，然后收獲細(xì)胞并用臺(tái)盼藍(lán)排除法評(píng)估細(xì)胞數(shù)量。在某些實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞與10μM的特異性IKKβ抑制劑SC-514和姜黃素共同培養(yǎng)4小時(shí)和24小時(shí)。用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒評(píng)估細(xì)胞凋亡。為了進(jìn)行自噬分析，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染了750ng pEX-HcRed-hLC3WT質(zhì)粒(編碼與HcRed熒光蛋白融合的LC3B蛋白)的B16黑色素瘤細(xì)胞。72小時(shí)后，用MetOH/丙酮1:1的比例固定所有不同處理的樣本，用磷酸鹽緩沖生理鹽水洗滌，然后用Prolong Gold Antifade試劑固定，并用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)反染色以鑒定細(xì)胞核。

采用熒光顯微鏡對(duì)LC3B點(diǎn)進(jìn)行定量，使用尼康相機(jī)和ACT-2U圖像軟件獲取圖像。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次，分析至少50個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。使用100倍倍率物鏡獲取圖像。

ROS生成分析

將腫瘤細(xì)胞播種到12孔板中，并按上述方法處理。細(xì)胞用1μM氧化敏感染料2?,7?二氯熒光素二乙酸酯在磷酸鹽緩沖鹽水中染色，37°C 30分鐘，然后用FACS Calibur或Gallios細(xì)胞儀和CellQuest或Kaluza軟件分析樣本。