材料與方法

測試沉積物和植物

沉積物樣品采自中國湖北省梁子湖（114°38'23"N, 30°14'28"E）。沉積物基本特征為：含水量72.5±1.3%，有機質（OM）8.85±0.86 g kg?1，總氮0.50±0.06 g kg?1，總磷0.45±0.05 g kg?1。孔隙水的化學組成為：銨態氮（NH?-N）4.39±1.29 mg l?1，硝態氮（NO?-N）0.22±0.07 mg l?1，pH 6.99±0.08。選擇菹草（Potamogeton crispus, Potmogetonaceae），一種常見的多年生草本沉水植物，作為本實驗的寄主植物。這種植物也是中國南方湖泊的本地種。

根箱設計

使用具有多層隔室的三隔室根箱培養菹草。根箱根據He et al.（2005）的設計進行了修改（圖1）。每株植物在培養期間完全浸入水箱（高度350毫米）底部。使用風干沉積物填充三個隔室。根箱包含三個部分：根區隔室（寬度20毫米）、近根際區隔室（5毫米）和非根際區隔室（>5毫米）。近根際區隔室通過尼龍網（<25μm）進一步分成五個子隔室（厚度1毫米），以防止根毛進入相鄰的沉積物夾層，并保持沉積物夾層中的微生物和根系分泌物分離。

植物培養與樣品采集

選擇六顆具有相似萌發時間和生長特性的菹草鱗莖種植在根區隔室。植物從2014年11月至2015年5月培養6個月。為了模擬淡水湖泊的低、中、富營養三種營養狀況，使用了緩釋尿素（魯西化工有限公司，聊城，山東，中國）作為營養輸入，濃度分別為0、400和600毫克尿素每千克沉積物。每個營養濃度實驗包含三個重復根箱。培養5個月后，植物根系填滿根區隔室，將緩釋尿素注入沉積物。在尿素注入后第0天開始，每隔14天采集樣品，持續56天，采集根區（R）、五個近根際區子隔室（N1-N5）和非根際區隔室（Non）的沉積物樣品（每種營養條件下三個平行樣品）。來自同一夾層的沉積物樣品混合，然后使用七個混合樣品進行DNA提取、克隆和測序，以檢測每個夾層是否存在類產氧甲烷桿菌。

理化指標測定和基因組DNA提取

在收集沉積物之前，使用微電極系統（Unisense, Aarhus, Denmark）原位測量根際沉積物的溶解氧（DO）和pH。由于微電極系統探針長度有限，測量深度為48毫米。根據測量的DO值確定每個近根際子隔室的氧滲透深度（Dop, DO > 6.25 μmol l?1）。收集的沉積物在4,000 rpm下離心10分鐘以獲得孔隙水。使用流動注射分析（SEAL Analytical AA3; SEAL Analytical, Norderstedt, Germany）測定孔隙水中NH?-N和NO?-N的濃度。

使用土壤快速DNA提取試劑盒（Fast DNA Spin Kit for Soil, MP Biomedicals, Fountain Parkway Solon, OH, USA）按照制造商的說明提取沉積物的基因組DNA。每次DNA分離使用約0.5克沉積物。提取的DNA隨后儲存在-20°C直至進一步分析。使用NanoDrop 2000紫外-可見分光光度計（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）測定DNA濃度，并通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢查質量。

擴增、克隆和測序

采用巢式PCR擴增類產氧甲烷桿菌的16S rRNA基因。第一步使用引物202F (5'-GACCAAAGGGGGCGAGCG-3') (Ettwig et al., 2009) 和1545R (5'-CAKAAAGGAGGTGATCC-3') (Juretschko et al., 1998)，第二步使用針對NC10細菌的特異性引物qP1F (5'-GGGCTTGACATCCCACGAACCTG-3') 和 qP2R (5'-CGCCTTCCTCCAGCTTGACGC-3') (Ettwig et al., 2009)。反應體系為：12.5 μl 2× High-Fidelity Master Mix (blue), 1 μl 正向引物 (10 μM), 1 μl 反向引物 (10 μM), 1 μl DNA模板 (20-50 ng μl?1), 和 9.5 μl ddH?O。PCR條件為：98°C預變性5分鐘；然后98°C變性10秒、56°C退火10秒、72°C延伸20秒，共35個循環；最后72°C延伸5分鐘。使用pClone 007載體連接試劑盒（TSING KE, 北京, 中國）對PCR產物進行克隆。從每個夾層隨機挑選約50個陽性克隆進行測序以構建克隆文庫。

統計分析

使用方差分析（最小顯著性差異法（LSD）和Tukey檢驗）檢測沉積物和孔隙水理化指標之間的顯著差異。應用3%的操作分類單元（OTU）截斷值來確定類產氧甲烷桿菌16S rRNA基因的遺傳多樣性，并使用Mothur程序（v.1.34.4）（Schloss et al., 2009）中的最遠鄰法（furthest neighbor method）進行序列聚類。使用ClustalW 1.6程序進行多序列比對。使用Mega 6軟件，采用鄰接法（neighbor-joining method）進行16S rRNA基因序列的系統發育分析。計算模型為Jukes-Cantor模型。使用1000次重復的Bootstrap分析來檢驗樹狀圖聚類的置信水平（Shen et al., 2014a）。使用Mothur軟件（v.1.34.4）生成Chao1估計量和香農指數以評估多樣性。本研究獲得的序列在NCBI數據庫中與產氧甲烷桿菌序列（FP565575）進行BLAST以獲取相似性，并在GenBank中上傳，登錄號為MH092300-MH092623。