肝臟組織病理學分析(Analysisofliverhistopathology)

在ConA注射后10小時從處死小鼠采集的肝臟左葉進行蘇木精-伊紅（H&E）染色以進行組織學分析。

脾淋巴細胞體外增殖及其促炎細胞因子產(chǎn)生分析(Invitroanalysesofproliferationofspleenlymphocytesandtheirproductionofproinflammatorycytokines)

通過密度梯度離心使用Histopaque（Sigma）從小鼠脾臟分離單核淋巴細胞（MNL）。在96孔板中，淋巴細胞（2×10?/孔）用溶解在補充有10%胎牛血清（FBS）、L-谷氨酰胺和抗生素的RPMI培養(yǎng)基中的H?（濃度分別為175、350和700μM）預處理。然后將96孔板中的細胞與ConA（1μg/ml）反應或不反應（作為對照）24小時，收集培養(yǎng)上清液進行TNF-α和IFN-γ的ELISA檢測。96孔板中的脾淋巴細胞在總共48小時培養(yǎng)的最后16小時進一步與[3H]胸苷（0.5μCi）孵育，并通過放射性閃爍計數(shù)器監(jiān)測增殖細胞中摻入的放射性（cpm）。

結(jié)果(Results)

H?是動物腸道中碳水化合物發(fā)酵的副產(chǎn)品。研究還表明，活體小鼠胃或肝臟中的H?濃度（約20-80μM）比表觀全細胞Km（米氏常數(shù)）值高出20多倍?；谶@一證據(jù)，我們假設(shè)腹部器官中如此高的H?水平來源于腸道細菌。為了驗證這一前提，給小鼠使用或不使用抗生素（磺胺甲惡唑和甲氧芐啶）處理3天，隨后使用無抗生素水休養(yǎng)2天。此后，通過在血瓊脂平板上培養(yǎng)新鮮糞便來確認抗生素對腸道菌群的抑制作用（對照組未處理小鼠，1.6±0.5×Log10?CFU/g；抗生素處理小鼠，7.0±6.1×Log10?CFU/g）。圖1A顯示了不同器官中的H?含量。盲腸中檢測到的H?量最高，其次依次為小腸、大腸、肝臟、脾臟和血液。在大腦中檢測到痕量水平的H?。小鼠全身性使用抗生素（磺胺甲惡唑和甲氧芐啶）處理顯著降低了所有測試器官中檢測到的H?量。離體糞便培養(yǎng)實驗也證明了抗生素對H?的影響（圖1B）。這些數(shù)據(jù)證明了抗生素依賴性的H?變化，無論是通過小鼠器官原位測量還是離體糞便培養(yǎng)，都表明腸道、肝臟和脾臟中的H?直接來源于常駐細菌。

為了探究產(chǎn)生H?的共生菌在腸道中的存在是否會影響小鼠對ConA誘導的肝損傷的易感性，向經(jīng)過或不經(jīng)過抗生素預處理的小鼠靜脈注射ConA（15mg/kg）（實驗方案A）?；€ALT和AST水平在預處理組和未處理組小鼠之間沒有差異（圖1C和D），表明抗生素沒有造成肝損傷。注射后2小時測得的血清ALT和AST水平在抗生素處理小鼠中顯著高于未處理小鼠（圖1C和D）。組織學分析也顯示，與未處理對照小鼠相比，抗生素處理小鼠的肝組織損傷更嚴重（見補充數(shù)據(jù)1），表明抗生素處理增加了小鼠對ConA誘導肝炎的易感性。換句話說，在沒有抗生素的情況下，腸道細菌菌群的存在似乎為抵抗ConA誘導肝炎的發(fā)生提供了足夠的保護。

如果腸道細菌產(chǎn)生的H?是保護肝臟免受ConA誘導炎癥的關(guān)鍵因素，那么外源性補充H?給抗生素處理的小鼠應該能夠下調(diào)肝臟炎癥。因此，在實驗方案B中，在ConA注射前12小時以及注射后0小時和3小時給抗生素處理的小鼠灌胃H?水溶液。如圖2B和C所示，H?水溶液顯著抑制了抗生素處理小鼠在ConA注射后6小時測得的炎癥生物標志物ALT和AST的升高。重要的是，由活化T細胞產(chǎn)生的血清促炎細胞因子TNF-α和IFN-γ的水平，也通過應用H?在抗生素處理小鼠中被顯著下調(diào)（圖2D和E）。

為了研究腸道細菌來源的H?對ConA誘導肝損傷的影響，用兩種不同的大腸桿菌菌株重建抗生素預處理小鼠的菌群：(1)產(chǎn)H?的大腸桿菌菌株W3110gfp?或(2)H?缺陷型大腸桿菌菌株P(guān)MD23gfp?；然后靜脈注射ConA（圖3A，實驗方案C；圖3B，W3110gfp?和PMD23gfp?的H?產(chǎn)量）。通過在含氨芐青霉素的瓊脂平板上培養(yǎng)小鼠糞便中回收的GFP?細菌，證實了在供應含氨芐青霉素飲用水的小鼠中兩種菌株的定植。在小鼠的小腸、大腸、盲腸和肝臟中檢測到W3110gfp?定植小鼠的H?量升高，而PMD23gfp?定植小鼠這些器官中的H?水平仍然很低（見補充數(shù)據(jù)2；可在線獲取）。與PMD23gfp?攜帶組或?qū)φ战M小鼠相比，W3110gfp?菌株小鼠在ConA注射后6小時收集的血清中ALT和AST水平顯著降低（圖3C和D）。PMD23gfp?攜帶組或?qū)φ战M小鼠相比，W3110gfp?攜帶小鼠血清中的TNF-α和IFN-γ水平也顯著受到抑制（圖3E和F）。因此，基于實驗方案A、B和C的結(jié)果，腸道細菌釋放的H?似乎在抑制ConA注射誘導的肝臟炎癥中發(fā)揮了作用。

人們認為從活化的T細胞釋放的TNF-α和IFN-γ在ConA誘導的肝炎模型中引起肝組織損傷。因此，為了探討H?是否會影響ConA刺激的T細胞產(chǎn)生TNF-α和IFN-γ，在體外用ConA刺激脾單核淋巴細胞（MNL），并在存在或不存在H?的情況下進行。如圖4所示，與在無H?條件下用ConA刺激MNL相比，培養(yǎng)基中存在H?顯著抑制了MNL的增殖（圖4A）以及TNF-α和IFN-γ的產(chǎn)生（圖4B和C）。值得注意的是，H?本身對未刺激MNL的增殖或IFN-γ的產(chǎn)生均無影響。因此，這項體外研究有力地支持了H?可以抑制ConA介導的T細胞活化的前提，而T細胞活化會導致組織破壞性的TNF-α和IFN-γ產(chǎn)生。

討論(Discussion)

積累的證據(jù)表明，腸道常駐細菌在其共生宿主關(guān)系中具有宿主保護功能。然而，支持這種細菌介導的宿主保護功能的潛在機制尚不清楚。一些研究揭示，無菌小鼠的腸道血管系統(tǒng)與常規(guī)小鼠相比發(fā)育不良，這表明腸道共生菌可以影響宿主體內(nèi)穩(wěn)態(tài)血管生成的發(fā)育。然而，由于本研究表明腸道常駐菌產(chǎn)生的H?對刀豆蛋白A（ConcanavalinA）誘導的小鼠肝炎具有抗炎作用，因此本研究揭示了一種由腸道定植菌介導的新型抗炎機制。如果腸道細菌釋放的H?確實如本研究的方案A、B和C所證明的那樣，在抑制ConA注射誘導的肝臟炎癥中發(fā)揮作用，那么共生菌促進的微毛細血管網(wǎng)絡(luò)可能通過血流促進H?的運輸就變得合情合理。

值得注意的是，口服施用的H?的抗炎效果高于腸道細菌釋放的H?。通常情況相反，因為細菌持續(xù)存在于腸道消化內(nèi)容物中（約1克/小鼠）釋放H?，而總飲水量約為2毫升/天/小鼠，并且飲用水中的所有H?會立即從胃中擴散出去。因此，我們研究中腸道細菌釋放的H?相對較低的抗炎效力，最可能歸因于位于腸道粘膜深處或胃中的其他細菌（如據(jù)報道會消耗大量H?的Helicobacterhepaticus）對H?的清除。為了證明這一假設(shè)，需要對口胃腸道粘膜中產(chǎn)生或消耗H?的細菌進行詳細分析。

雖然以往大多數(shù)研究H?生物學效應的研究關(guān)注的是由器官（如肝臟和大腦）缺血再灌注引起的氧化性組織損傷，但H?是否也能影響由淋巴細胞活化引發(fā)的炎癥尚不清楚。因此，本研究的創(chuàng)新之處在于發(fā)現(xiàn)共生菌產(chǎn)生的分子氫（H?）似乎能抑制ConA刺激的淋巴細胞產(chǎn)生組織破壞性的促炎細胞因子TNF-α和IFN-γ。此外，ROS可以通過上調(diào)NF-κB信號通路激活TNF-α的表達，同時它也能激活NADPH氧化酶（NOX）的表達，該酶從NADPH產(chǎn)生ROS。因此，炎癥和氧化過程是相互關(guān)聯(lián)的。ROS與炎癥之間如此復雜的交叉反應表明，H?介導的ConA刺激淋巴細胞產(chǎn)生的TNF-α和IFN-γ的抑制也可能涉及H?的抗氧化效應。

總之，本研究表明，腸道定植菌釋放的H?可以抑制刀豆蛋白A（ConcanavalinA）在肝臟誘導的炎癥，并且全身性抗生素處理可能改變腸道內(nèi)具有宿主保護作用的共生菌群數(shù)量，最終導致肝臟中H?濃度降低。由于大多數(shù)哺乳動物缺乏產(chǎn)生H?的分解代謝酶，腸道細菌是肝臟中保護性H?的唯一可能來源。事實上，共生菌在宿主防御中的作用之一可能是由常駐菌群產(chǎn)生抗炎H?的能力所定義的。因此，外源性因素，如引入抗生素，可能會影響H?的功能量，從而影響機體對疾病的易感性。