摘要(ABSTRACT)

眾所周知，一些腸道細菌，如大腸桿菌（Escherichiacoli），能產生大量的分子氫（H?）。雖然H?的抗氧化作用已有充分記載，但本研究探討了腸道定植菌釋放的H?是否會影響刀豆蛋白A（ConA）誘導的小鼠肝炎。全身性抗生素處理顯著降低了肝臟和腸道中的H?水平，并抑制了腸道細菌。通過測定血清中的AST、ALT、TNF-α和IFN-γ水平發現，抗生素抑制腸道菌群加重了ConA誘導的肝炎，而用產H?的大腸桿菌重建腸道菌群（而非H?缺陷型突變大腸桿菌）則下調了ConA誘導的肝臟炎癥。此外，體外實驗表明，ConA刺激的脾淋巴細胞產生的TNF-α和IFN-γ均可被引入H?顯著抑制。這些結果表明，腸道細菌釋放的H?可以抑制ConA在肝臟中誘導的炎癥。

引言(Introduction)

分子氫（H?）溶于水的抗氧化作用在缺血再灌注誘導的小鼠腦損傷模型中得到了證實。隨后的幾項研究也表明，H?可以抑制由缺血再灌注后氧化應激引起的器官（如肝臟、腸道和心臟）組織損傷。由于炎癥與氧化應激之間的聯系（彼此激活）已被充分認識，一種高效的抗氧化劑也應能抑制組織破壞性疾病中誘導的炎癥。然而，關于H?抗炎方面的報道很少見。

重要的是，在以往使用動物模型的研究中，H?是以氣體形式或溶于水后外源性施用于動物。但是，同樣不可否認的是，一些腸道細菌，如大腸桿菌（E.coli），因其擁有氫化酶而能夠產生H?。如果腸道細菌確實會釋放H?，那么這種內部產生的H?應該會影響宿主對氧化應激和炎癥應激的抵抗力。然而，迄今為止，尚無研究探討腸道細菌產生的H?對宿主抵抗炎癥刺激的影響。

刀豆蛋白A（ConcanavalinA,ConA）是一種凝集素，能凝集血液紅細胞，也是一種主要刺激T細胞的促分裂素。因此，它通過活化的淋巴細胞浸潤引起急性炎癥，導致肝細胞大量壞死性組織損傷并伴有肝竇內充血。因此，ConA誘導的肝炎已被用作一種實驗性小鼠模型，其反映了人類自身免疫性肝炎的大部分致病特性。無胸腺裸鼠和SCID小鼠對ConA誘導的肝炎具有抵抗力，這清楚地證明了T細胞在誘導ConA介導的肝損傷中的允許作用。盡管ConA造成的組織損傷僅限于肝臟，但這種器官特異性的潛在機制仍不清楚。然而，ConA介導的T細胞活化也會增加血液中促炎細胞因子的水平，包括腫瘤壞死因子α（TNF-α）和干擾素γ（IFN-γ），它們由活化的T細胞釋放，并被認為在ConA誘導的肝臟炎癥的發展中起關鍵作用。

本研究利用刀豆蛋白A誘導的急性肝炎小鼠模型，探討了(1)腸道定植菌釋放的H?量以及(2)腸道細菌釋放的H?對肝臟誘導的炎癥的影響。

材料與方法(Materialsandmethods)

動物(Animals)

使用C57BL/6j小鼠（8-10周齡雄性），飼養于恒溫的常規房間中，保持12小時光暗周期。本研究采用的實驗程序得到了ForsythIACUC的批準。

建立表達GFP的大腸桿菌(EstablishmentofGFP-expressingE.coli)

本研究使用大腸桿菌菌株W3110（ATCC27325）及其HypF基因缺失突變株PMD23（該菌株不產生H?）（補充材料1；可在線獲?。?。HypF對于活性氫化酶的合成是必不可少的，因為缺少它會導致氫化酶活性降低>95%。通過電穿孔，兩種大腸桿菌菌株均用pGFPuv載體（Clontech,MountainView,CA）轉染，該載體在啟動子中含有氨芐青霉素抗性基因（Amp?）。所得的兩株菌為：大腸桿菌W3110gfp?（Amp??/GFP?/HypF?）和大腸桿菌PMD23gfp?（Amp??/GFP?/HypF?）。它們在含有氨芐青霉素（100μg/ml）的LB肉湯中培養。

分子氫的測量(Measurementofmolecularhydrogen)

使用針型氫傳感器（UnisenseA/S,Aarhus,Denmark）測量小鼠器官中產生的分子氫（H?），方法遵循Hayashida等人發表的方法。小鼠在CO?吸入麻醉下處死后，立即將針型氫傳感器放入用25G針頭在器官中預先制備的引導路徑中?；蛘?，將氫傳感器直接放入通過心臟穿刺采集的血液中。H?的標準陽性濃度是在大氣壓下將H?氣體飽和于水中制備（25°C時為781μM或37°C時為721μM），而未處理的對照水則用于表示H?量為0μM。始終考慮H?的擴散因子并進行調整（例如，塑料管中采血樣本的擴散速率為0.7μM/min）。

制備H?水溶液(GenerationofH?dissolvedwater)

將高純度H?氣體（Airgas,Salem,NH）注入水或培養基中，直至H?濃度達到飽和（25°C時為780μM）。然后，通過稀釋制備適當濃度的H?溶液。飽和H?水溶液的pH值為7.6，氧化還原電位（ORP）非常高（-511mV）。

刀豆蛋白A誘導的急性肝炎模型(ConcanavalinA-inducedacutehepatitismodel)

實驗方案A(ExperimentalProtocol-A):(1)小鼠自由飲用含有抗生素混合物（磺胺甲惡唑，8mg/ml和甲氧芐啶，1.6mg/ml）的水或對照無抗生素水，持續3天。(2)隨后兩天，兩組動物均自由飲用無抗生素水進行休養。(3)向兩組小鼠靜脈注射ConA（Sigma,St.Louis,MO,15mg/kg；生理鹽水溶液），并在注射后0、2和10小時監測血清中的ALT和AST水平。

實驗方案B(ExperimentalProtocol-B):(1)小鼠自由飲用含有抗生素混合物（磺胺甲惡唑，4mg/ml；甲氧芐啶，0.8mg/ml；和氨芐青霉素，0.1mg/ml）的水，持續3天。(2)隨后三天，動物繼續自由飲用含有氨芐青霉素（0.1mg/ml）的水。(3)向兩組小鼠注射ConA（15mg/kg，生理鹽水溶液）：(a)一組在注射前12小時以及注射后0小時和3小時灌胃給予H?富集水（780μM,pH7.6,1ml/只，n=5/組）；(b)另一組給予對照水（1ml/只，n=5/組）。ConA注射后，兩組小鼠仍供應含有氨芐青霉素的飲用水。實驗方案B的示意圖見圖2A。

實驗方案C(ExperimentalProtocol-C):(1)小鼠自由飲用與方案B相同的三種抗生素混合物水，持續3天。(2)隨后三天，動物自由飲用含有氨芐青霉素（1mg/ml）的水。(3)向兩組小鼠注射ConA（15mg/kg，生理鹽水溶液）：(a)一組用大腸桿菌W3110gfp?重建菌群（n=5/組）；(b)另一組用大腸桿菌PMD23gfp?定植（n=5/組）。將在對數生長期中期的兩株大腸桿菌收集起來，在ConA注射前2天，使用Popper灌胃針灌胃給予小鼠（10?細菌/100μl含5%羧甲基纖維素的生理鹽水/只）。ConA注射后，兩組小鼠仍供應含有氨芐青霉素的飲用水。實驗方案C的示意圖見圖3A。

肝臟炎癥生物標志物和促炎細胞因子的測量(Measurementofliverinflammationbiomarkersandproinflammatorycytokines)

通過檢測試劑盒并按照制造商的說明（BiotronDiagnostics,Hemet,CA）測定血清中的丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉移酶（AST）水平來分析肝損傷程度。促炎細胞因子TNF-α和IFN-γ的定量使用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（PeproTech,RockyHill,NJ）進行。