用失明小鼠的視網(wǎng)膜進(jìn)行體外驗(yàn)證。

圖6、用視網(wǎng)膜外植體進(jìn)行體內(nèi)評估。

接下來，我們測試了PDMS光伏界面在刺激RGC(視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞)方面的體內(nèi)外功效。為此，我們使用了視網(wǎng)膜變性小鼠模型，該模型被公認(rèn)為是視網(wǎng)膜色素變性的絕佳模型。為了盡可能避免存活光感受器的自然反應(yīng)，我們從老齡小鼠的視網(wǎng)膜上采集了假體誘發(fā)的RGCs尖峰活動(dòng)的胞外記錄。視網(wǎng)膜被分層覆蓋在PDMS-光伏界面中央5毫米的區(qū)域上，模擬視網(wǎng)膜外結(jié)構(gòu)(圖6a)。根據(jù)PC密度測定結(jié)果，我們只測試了10ms脈沖(PC響應(yīng)峰值)，輻照度范圍很廣(從47.35到29.07μW mm-2)。光脈沖在記錄的RGC中誘發(fā)了假體誘發(fā)的尖峰活動(dòng)(圖6b)。尖峰用閾值算法檢測(圖6b)，轉(zhuǎn)換成光柵圖，并顯示為刺激周時(shí)間直方圖。正如之前所報(bào)道的，我們觀察到了三種類型的反應(yīng)，分別為短潛伏期、中潛伏期和長潛伏期(SL、ML和LL)。SL尖峰的出現(xiàn)(在光開始后10ms內(nèi)誘發(fā)，1個(gè)分區(qū))表明RGC受到了直接的電刺激；而ML和LL尖峰的出現(xiàn)則表明網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)的激活。我們發(fā)現(xiàn)，從測試的第一個(gè)輻照度(47.35μW mm-2)開始就能誘發(fā)SL尖峰，然后發(fā)射率緩慢上升，并在1.08mW mm-2以上保持穩(wěn)定，直到測試的最高輻照度(圖6c)。然而，第一個(gè)輻照度下的平均潛伏期(圖6d)相對較長(6.05±0.23ms)；隨著輻照度的增加，潛伏期逐漸縮短，當(dāng)輻照度高于1.08mW mm-2時(shí)，潛伏期穩(wěn)定在4.12±0.07ms(圖6d)。在此范圍內(nèi)(高于1.08)，輻照度的平均抖動(dòng)為0.39±0.05ms。這表明，在輻照度高于1.08mW mm-2時(shí)，SL響應(yīng)達(dá)到飽和，這與PC密度的測量結(jié)果相符。當(dāng)輻照度低于1.08mW/mm2時(shí)，平均延遲時(shí)間似乎更短，但抖動(dòng)變化更大，表明響應(yīng)更不穩(wěn)定(圖6d)。ML(圖6e)和LL(圖6f)尖峰的發(fā)射率逐漸增加，但在1.08mW mm-2之后也變得穩(wěn)定。作為對照，當(dāng)視網(wǎng)膜分層在裸露的PDMS基底面上時(shí)，在所有測試的輻照度下均未檢測到光誘發(fā)反應(yīng)。正如其他人已經(jīng)證明的那樣，我們還在第二個(gè)細(xì)胞亞群中驗(yàn)證了使用突觸阻斷劑可以取消ML和LL尖峰的人工激活。這證實(shí)了ML和LL是由內(nèi)部視網(wǎng)膜回路激活誘發(fā)的假設(shè)。

空間選擇性。

圖7、假體刺激的空間限制。

然后，我們采用實(shí)驗(yàn)/計(jì)算混合方法來解決空間選擇性問題。首先，我們使用玻璃微電極(圖7a、b)測量了單個(gè)像素被照亮?xí)r三個(gè)方向(D1、D2和D3)的徑向電壓擴(kuò)散(圖7c)。對于每個(gè)被照亮的像素，三個(gè)主要方向上的歸一化電壓擴(kuò)散都已取平均值。所有測試像素的平均電壓分布已繪制并用高斯函數(shù)插值(圖7d)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與有限元分析(FEA)模型獲得的歸一化電壓分布圖相吻合(圖7d，藍(lán)色虛線)。模擬曲線的半最大值全寬(FWHM)(圖7d，灰色虛線)被視為有效活化面積，約為100微米。有限元分析模擬用于描述照明誘導(dǎo)的直徑不斷增大的歸一化電壓曲線(圖7e)。光斑尺寸從1像素增加到7像素和19像素會(huì)增加電位。最后，我們模擬了不同激活模式的影響(圖7f)。在所有情況下，都顯示了與光照模式相對應(yīng)的空間選擇性電位曲線。

細(xì)胞毒性和長期功能。

圖8、視網(wǎng)膜假體的使用壽命。

為了驗(yàn)證POLYRETINA的長期功能，我們測試了半球形的機(jī)械影響。為此，我們在圓球形的PDMS支架上粘接了PDMS光伏界面。粘合過程會(huì)在PDMS光伏界面上產(chǎn)生拉伸應(yīng)力，導(dǎo)致聚合物和鈦陰極出現(xiàn)裂縫(圖8a，上排)。為避免鈦陰極出現(xiàn)裂縫，在接口基底的每個(gè)陰極下方都集成了SU-8剛性平臺(tái)。有了這一預(yù)防措施，SU-8硬質(zhì)平臺(tái)上方的像素就不會(huì)出現(xiàn)裂縫(圖8a，底排)；圖像與圖1c中的綠色區(qū)域相對應(yīng)。在SU-8硬質(zhì)平臺(tái)之間的混合薄膜內(nèi)仍會(huì)出現(xiàn)裂縫，但這并不那么重要，因?yàn)樵搮^(qū)域已被PDMS封裝，以防止分層，而且在陰極定義區(qū)域外光產(chǎn)生的載流子不會(huì)對電極/電解質(zhì)界面產(chǎn)生的光電勢/電流產(chǎn)生重大影響。然后，我們使用KPFM測量表面電位的變化(圖8b)。由于假體呈半球形，原子力顯微鏡針尖只能觸及假體頂部的電極(直徑80微米，開口67微米)。與平面PDMS表面相比，照明引起的表面電位變化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖8c)。

為了模擬POLYRETINA植入后的壽命，我們將其浸泡在87°C的生理鹽水溶液中進(jìn)行了功能性加速老化測試(圖8d)。在老化開始前和實(shí)驗(yàn)過程中的幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)，用KPFM測量了光照后表面電位的變化(圖8e)。在加速老化24個(gè)月前，平均表面電位無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義變化。加速老化說明其使用壽命至少為2年。最后，根據(jù)ISO 10993-5：醫(yī)療器械的生物學(xué)評價(jià)，通過提取小鼠成纖維細(xì)胞L929進(jìn)行體外細(xì)胞毒性評價(jià)。通過XTT細(xì)胞活力測定法估計(jì)細(xì)胞活力。結(jié)果顯示假體的存活率為100%，陽性對照為0.3%，陰性對照為100%。通過體外細(xì)胞毒性評價(jià)結(jié)果說明，它對細(xì)胞沒有毒性。