摘要

測試的假設是，胚胎代謝會影響邊界層的水化學。此外，胚胎擁擠會進一步加劇新陳代謝對邊界層水化學的影響。隨著發育的進行，邊界層中氧氣和pH的梯度增加，但NH4+的梯度沒有增加。卵囊的存在阻礙了O2向胚胎的擴散以及H+和NH4+向胚胎的擴散。當胚胎被假胚胎或活胚胎包圍時，O2、pH和NH4+邊界層梯度的大小明顯增加。這種對胚胎邊界層的擁擠效應大部分是由于水流的變化而不是直接由于新陳代謝造成的。這些結果清楚地表明，隨著卵囊的存在，發育中的虹鱒胚胎附近的微環境會變得更加停滯，而胚胎擁擠則會進一步加劇這種停滯。

引言

在湖泊、河流和溪流中，鮭科胚胎在被稱為河床產卵區的礫石穴中發育。雌性鮭科通常會選擇水流相對較急的水系，但河床產卵區內的水流可能比地表水低兩個數量級。低水流的一個后果是，小型水生生物(如魚類胚胎)附近的邊界層厚度增加。邊界層是胚胎卵囊或絨毛膜附近的半停滯(無攪拌)水層，是胚胎與環境之間的界面。邊界層對于進行切面呼吸的生物來說更為重要。鮭科胚胎在孵化后很長時間內都會通過皮膚外表面進行氣體交換。之前的研究表明，虹鱒魚胚胎周圍存在氧氣邊界層，隨著胚胎的發育，邊界層梯度的大小會隨著新陳代謝的增加而增加。同樣，發育中的胚胎排出的呼吸廢物(如氨、CO2和H+)可能會在靠近胚胎的邊界層積聚。

早期階段發生在卵囊中的事實也可能加劇發育中胚胎附近的停滯微環境。卵囊是一種無細胞外殼，具有跨膜孔道，允許水和無機離子等小分子質量的分子運動，但不允許較大的蛋白膠體運動。盡管小分子可通過這些孔道自由移動，但卵囊還是為氧氣創造了一個擴散分區，因此相對于卵囊表面而言，細胞周液(PVF)中的氧氣濃度要低得多。同樣，卵囊也可能延遲代謝廢物的有效清除，因此，浸泡胚胎的PVF中的氨、CO2和H+濃度會升高。在以前對虹鱒的研究中，結果表明孵化前胚胎的PVF pH值和氨水平與外部環境不同，但未對無囊胚胎進行匹配測量。

另一個可能強烈影響河床產卵區水化學的重要因素是胚胎擁擠。據了解，一個卵囊中相鄰的鮭科胚胎數量可達900-1300個。在各種無脊椎動物和脊椎動物中，當胚胎擁擠在巢穴中時，相鄰的個體會消耗氧氣并降低pH值。據了解，對自然、擁擠的鮭科河床產卵區中氧氣耗盡和廢物積累的微觀測量尚未發表，這可能是因為技術上的困難，如在不干擾正常水流的情況下將胚胎置于礫石底層之下。從理論上講，低水流或擁擠會增加邊界層效應，有可能影響鮭科胚胎的生長和發育。在以前對鮭科胚胎進行的實驗室研究中，水流的兩倍變化會導致氧氣邊界層梯度的相應變化，但沒有考慮鄰近胚胎的影響。因此，本研究的目的之一是在受控實驗室條件下描述胚胎擁擠的影響。

測試的假設是，胚胎代謝會影響邊界層的水化學。據預測，在發育后期，邊界層的pH值(也包括氧氣含量)會進一步下降，邊界層的氨濃度會進一步上升。另一個預測是，胚胎擁擠會加劇新陳代謝對邊界層水化學的影響。為了驗證這兩個預測，我們測定了氧氣、pH值和氨的邊界層梯度。為了測試發育的影響，測量了受精后15-16天、22-23天和29-30天(dpf)的虹鱒胚胎以及29-30天和43-44天(10℃)的幼魚的邊界層梯度。為了驗證胚胎擁擠的預測，對單個胚胎的邊界層梯度進行了測量，周圍是處于同一發育階段的活胚胎或假胚胎，以控制任何水流干擾效應。根據預測，胚胎擁擠處理會增加整體代謝活動并影響水流，而假胚胎只會影響水流條件，不會對生物產生影響。

材料與方法

實驗動物

虹鱒胚胎在受精當天從虹鱒魚養殖場購買，然后運到安大略省圭爾夫市圭爾夫大學的哈根水產實驗室。胚胎被放置在Heath托盤中，托盤中的井水流動溫度為10℃[O2 0.31mmol/l，pH7.9，CaCO3水硬度為411mg/l，離子濃度(mmol/l)：2.6Ca2+、1.5Cl-、1.5Mg2+、0.06K+和1.1Na+]，條件與該地區鮭科產卵棲息地相似。在這些條件下，胚胎在14dpf長出眼睛，在29至30dpf之間孵化。來自三個不同雌性的胚胎由多個雄性受精，以增加后代的遺傳變異性。

實驗步驟

進行了三個系列的實驗：系列I，發育中的胚胎或幼魚邊界層的水化學；系列II，有卵囊或無卵囊的胚胎邊界層的水化學；系列III，胚胎擁擠對邊界層條件的影響。

實驗時，將胚胎放置在一個有機玻璃室(長7.5厘米×寬3.3厘米×深2厘米)中，以每分鐘4毫升的速度提供流動的冷凍(10℃)充氣循環井水，并靜置30分鐘，以便形成邊界層。事實證明，這足以形成氧氣邊界層。邊界層測量是通過安裝在微機械手上的氧氣、pH值或氨微電極進行的。微電極尖端直徑為25-50微米，90%的響應時間為2-4秒。兩次測量之間有30秒的穩定期。測量在胚胎的卵囊表面或幼魚的卵囊上進行，以100μm為間隔縮回至1000μm。關于魚類幼魚的主要交換區域，文獻中的報道相互矛盾。Rombough報告說，所有皮膚區域的攝氧量大致相同，而其他研究則表明，卵囊表面是體內離子(H+和NH4+)移動最多的區域。鑒于這些差異，我們選擇對卵囊的邊界層條件進行測量。

在初步試驗中，嘗試使用手工制作的微電極測量邊界層中的CO2水含量。但這些微電極不穩定，測量結果不可靠，而且水中CO2濃度較低，也給測量帶來了困難。因此，放棄了直接測量CO2。通過測量邊界層的pH值，結合直接排出的H+和排出的CO2部分水合在水中產生的H+進行了測量。

使用商用微電極(Unisense)測量氧氣。在擁擠實驗(系列III)中，使用了氧針探針(Lazar)。為校準氧電極，使用了無氧校準溶液(2mol/l Na2SO3)和100%氧飽和溶液，如先前報告所述。在測量pH值和氨時，微電極是根據O'Donnell和Litwiller等人的方法在實驗室制備的。為了校準pH值微電極，使用了在井水中制備的10mmol/l Hepes緩沖溶液，并用0.1mmol/l NaOH或0.1mmol/l HCl調節pH值至8.5和6.5(或至少相差1個pH單位)。氨的測量是在人工井水中進行的，井水中的鉀離子和鈉離子濃度較低，因為這些離子會干擾氨選擇性離子膜。先前的研究表明，不含Na+的水并不會改變虹鱒胚胎的氨排泄率。人工井水是用反滲透水(pH值7.9)制備的，其離子成分如下(毫摩爾/升)：0.8 MgSO4、0.7 MgCl2、2.6 CaSO4和0.1 NaHCO3。校準溶液由0.01、0.10和1.00mmol/l NH4Cl人工井水組成。