結(jié)果

一小部分細(xì)菌基因組在部分（“孤兒”）操縱子中編碼cbb3型氧化酶亞基

生化、遺傳和基因組分析表明，通常由操縱子編碼的CcoN和CcoO亞基形成cbb3型氧化酶的最小功能單元（Ducluzeau et al.,2008;de Gier et al.,1996;Zufferey et al.,1996）。CcoN是膜整合的催化亞基，包含兩個(gè)b型血紅素和一個(gè)銅離子。CcoO是膜錨定的，包含一個(gè)c型血紅素。額外的氧化還原亞基和/或參與復(fù)合物組裝的亞基，如CcoQ和CcoP，可以由相鄰基因編碼（圖1B）。ccoNO包含的簇廣泛分布于細(xì)菌域的多個(gè)門（Ducluzeau et al.,2008）。我們使用EggNOG數(shù)據(jù)庫（包含超過3000種細(xì)菌物種的代表性基因組（Huerta-Cepas et al.,2016））來獲取關(guān)于cco基因存在和頻率的概覽。在查詢的3318個(gè)細(xì)菌基因組中，我們發(fā)現(xiàn)467個(gè)具有完整的cco操縱子（編碼具有O和N亞基的潛在功能性cbb3型氧化酶）。其中，78個(gè)包含多于一個(gè)完整的操縱子。我們還使用EggNOG通過檢查單個(gè)基因組中ccoO和ccoN同源物的相對(duì)數(shù)量來尋找孤兒ccoN基因。我們發(fā)現(xiàn)了14個(gè)基因組，其中假單胞菌屬物種占比過高，它們包含孤兒ccoN基因（圖1C），我們的分析產(chǎn)生了三個(gè)包含不止一個(gè)孤兒ccoN基因的物種：門多薩假單胞菌（Pseudomonas mendocina）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和木糖氧化無色桿菌（Achromobacter xylosoxidans）。門多薩假單胞菌是一種土壤細(xì)菌和偶發(fā)的醫(yī)院病原體，基于16S rRNA基因序列比較（Anzai et al.,2000）與銅綠假單胞菌密切相關(guān)。相反，木糖氧化無色桿菌屬于一個(gè)不同的變形菌綱，但盡管如此，它經(jīng)常被誤認(rèn)為是銅綠假單胞菌（Saiman et al.,2001）。與銅綠假單胞菌類似，它是一種機(jī)會(huì)性病原體，可在免疫功能低下個(gè)體和囊性纖維化患者中引起肺部感染（De Baets et al.,2007;Firmida et al.,2016）。Hirai等人先前報(bào)道了基于ClustalW對(duì)假單胞菌屬CcoN同源物的分析，表明在EggNOG數(shù)據(jù)庫中未代表的額外物種中也存在孤兒基因。這些包括反硝化假單胞菌（P.denitrificans），它包含兩個(gè)孤兒基因（Hirai et al.,2016）。

含CcoN4的異源復(fù)合物對(duì)形態(tài)發(fā)生和呼吸作用具有生物膜特異性貢獻(xiàn)

在生物膜中生長期間，細(xì)胞群體會(huì)遇到不同的電子供體和受體可用性條件，這與其在充分混合的液體培養(yǎng)物中遇到的條件不同。我們因此使用菌落形態(tài)分析研究了單個(gè)cco基因和基因簇對(duì)銅綠假單胞菌PA14生物膜發(fā)育的貢獻(xiàn)，該分析已證明對(duì)電子受體可用性和利用具有敏感性（Dietrich et al.,2013）。由于Cco1和Cco2復(fù)合物是銅綠假單胞菌在充分通氣和O2限制的液體培養(yǎng)物中生長最重要的細(xì)胞色素氧化酶（Alvarez-Ortega and Harwood,2007;Arai et al.,2014），我們預(yù)測(cè)使Cco1和Cco2功能失活的突變會(huì)影響菌落生長。確實(shí)，缺乏cco1和cco2操縱子的突變體（‘Acco1cco2’）產(chǎn)生了比野生型更薄的生物膜，直徑更小。發(fā)育5天后，該突變體表現(xiàn)出顯著的表型，包括一個(gè)高大的中央環(huán)狀結(jié)構(gòu)，周圍環(huán)繞著向外輻射的短脊（圖2A，圖2-圖補(bǔ)充1A）。Dcco1cco2菌落顏色也更深，表明吸收剛果紅染料增加，該染料與生物膜產(chǎn)生的胞外基質(zhì)結(jié)合（Friedman and Kolter,2004）。令人驚訝的是，特異性缺失Cco1和Cco2催化亞基的菌株（‘ΔN1ΔN2’），雖然在液體培養(yǎng)中顯示出與Acco1cco2相似的生長缺陷（圖2C），但在生物膜發(fā)育方面與野生型相似（圖2A，圖2-圖補(bǔ)充1A）。

圖2含CcoN4的異質(zhì)復(fù)合體對(duì)生物膜的形態(tài)發(fā)生和呼吸有特異性貢獻(xiàn)。(A)上層：PA14 WT和cco突變株五天大的菌落生物膜。生物膜形態(tài)代表10個(gè)以上的生物重復(fù)。圖像使用數(shù)碼顯微鏡生成。比例尺為1厘米。下層：上圖所示生物膜的三維表面圖像。圖像使用廣域三維測(cè)量系統(tǒng)生成。高度刻度線：從底部(藍(lán)色)到頂部(紅色)，WT、ΔN1ΔN2和ΔN4為0-0.7；ΔN1ΔN2ΔN4和Δcco1cco2為0-1.5毫米。(B)WT和cco突變體菌落生長1天后的TTC還原。還原時(shí)，TTC發(fā)生不可逆的顏色變化，從無色變?yōu)榧t色。條形圖代表單獨(dú)繪制的生物重復(fù)(n=5)的平均值，誤差條代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。(C)PA14 WT和cco突變株在含20mM琥珀酸的MOPS定義培養(yǎng)基中的平均生長情況。誤差條代表生物三重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

由于已知在銅綠假單胞菌PAO1中，CcoN3和CcoN4可以與Cco1和Cco2氧化酶的亞基形成功能性復(fù)合物（Hirai et al.,2016），這使我們假設(shè)含有孤兒亞基CcoN3和/或CcoN4的Cco異構(gòu)體可以在生物膜背景下替代Cco1和Cco2。刪除ccoN3（‘△N3’或‘△N1AN2AN3’）在突變體與相應(yīng)親本菌株比較時(shí)未觀察到對(duì)生物膜發(fā)育的影響（圖2-圖補(bǔ)充1A）。然而，‘△N1△N2△N4’突變體的表型符合我們的模型，因?yàn)樗谝后w培養(yǎng)和生物膜生長中都模擬了Acco1cco2突變體（圖2A和C，圖2-圖補(bǔ)充1A）。此外，我們發(fā)現(xiàn)僅缺失ccoN4的突變體（‘△N4’）顯示出改變的表型，即它比野生型更早開始形成皺紋結(jié)構(gòu)（圖2-圖補(bǔ)充1A），最終發(fā)展成一個(gè)中央環(huán)內(nèi)皺紋無序區(qū)域，周圍環(huán)繞著長而向外輻射的脊（圖2A）。將ccoN4基因重新引入這些菌株中的任何一個(gè)都恢復(fù)了相應(yīng)親本菌株的表型（圖2-圖補(bǔ)充1A）。在△N4背景下刪除ccoN2或ccoN3都沒有加劇僅在△N4中觀察到的菌落表型。然而，‘ΔN1ΔN4’雙突變體顯示出相對(duì)于△N4和△N1AN2AN4的中間表型（圖2-圖補(bǔ)充1B），表明CcoN1和CcoN4存在一定的功能冗余。△N4菌落的發(fā)育模式讓人聯(lián)想到吩嗪生產(chǎn)和感應(yīng)缺陷突變體的模式（圖2-圖補(bǔ)充1A）（Dietrich et al.,2008;2013;Sakhtah et al.,2016;Okegbe et al.,2017）。盡管△N4本身在菌落形態(tài)分析中顯示出獨(dú)特的表型，但其在振蕩液體培養(yǎng)物中的生長與野生型無法區(qū)分（圖2C）。最后，刪除三種非cbb3型末端氧化酶（‘AcoxAcyoAcio’）并未影響生物膜形態(tài)（圖2-圖補(bǔ)充2C）。這些結(jié)果表明，含CcoN4的Cco異構(gòu)體可能在生物膜中發(fā)揮特定的生理作用。

接下來，我們?cè)儐朇coN4是否有助于生物膜中的呼吸作用。我們測(cè)試了一系列cco突變體對(duì)氯化三苯基四氮唑（TTC）的還原能力，該活性與細(xì)胞色素c氧化酶依賴性呼吸相關(guān)（Rich et al.,2001）。Acco1cco2突變體在TTC還原方面表現(xiàn)出嚴(yán)重缺陷，ΔN1ΔN2ΔN4突變體重現(xiàn)了這一缺陷。與菌落形態(tài)分析一樣，僅缺失CcoN1和CcoN2的突變體并未重現(xiàn)這種極端表型，表明CcoN4有助于PA14生物膜中的呼吸活性。雖然我們?cè)凇鱊4突變體中沒有檢測(cè)到TTC還原缺陷，但我們觀察到ΔN1ΔN4的TTC還原水平介于ΔN1ΔN2和ΔN1ΔN2ΔN4之間，進(jìn)一步表明CcoN4亞基參與此活性（圖2B）。

最近的一項(xiàng)研究證明了CcoN4在抵抗氰化物中的作用，氰化物是銅綠假單胞菌產(chǎn)生的一種呼吸毒素（Hirai et al.,2016）。因此，ΔN4突變體改變的生物膜表型可能歸因于其在生物膜生長期間對(duì)產(chǎn)生的氰化物敏感性增加。我們刪除了hcn操縱子（編碼氰化物生物合成酶），在野生型、吩嗪缺失（Aphz）和各種cco突變體背景下進(jìn)行了測(cè)試。這些菌株的生物膜形態(tài)和液體培養(yǎng)生長不受△hcnABC突變的影響，表明本研究中探索的CcoN4的生物膜特異性作用與其在介導(dǎo)氰化物抗性中的作用無關(guān)（圖2-圖補(bǔ)充2）。此外，我們檢查了假單胞菌基因組數(shù)據(jù)庫中可用的基因組中編碼CcoN亞基（ccoN基因）和氰化物合成酶（hcnABC）（Winsor et al.,2016）的同源物存在情況，并未發(fā)現(xiàn)hcnABC和ccoN4同源物之間存在明確的相關(guān)性（圖2-圖補(bǔ)充3）。

總之，我們?cè)诰湫螒B(tài)發(fā)生和TTC還原分析中觀察到的cco基因突變效應(yīng)表明，一種或多種含CcoN4的Cco異構(gòu)體支持呼吸作用和氧化還原平衡，并且在生物膜中，與含CcoN1和CcoN2的Cco復(fù)合物相比，其優(yōu)先被利用。我們對(duì)PA14基因組編碼的CcoN亞基進(jìn)行了序列比對(duì)，并鑒定了CcoN4特有或CcoN4與CcoN1（在我們的分析中顯示出與CcoN4最強(qiáng)的功能冗余）共有的獨(dú)特殘基（圖2-圖補(bǔ)充4A）。我們還利用施氏假單胞菌CcoN亞基的可用結(jié)構(gòu)（Buschmann et al.,2010）對(duì)CcoN4序列進(jìn)行了穿線法建模，并高亮了這些殘基（圖2-圖補(bǔ)充4B）。值得注意的是，大多數(shù)高亮的殘基暴露在表面，特別是在預(yù)測(cè)的CcoN4結(jié)構(gòu)的一半上，它們可能在那里結(jié)合未知的蛋白質(zhì)伴侶或特定脂質(zhì)。相反，被描述為與CcoO和CcoP相互作用的位點(diǎn)大部分是保守的，進(jìn)一步支持了CcoN4可以在Cco復(fù)合物中與這些亞基相互作用的觀點(diǎn)。