競(jìng)爭性試驗(yàn)

熒光菌株(表達(dá)YFP)和非熒光菌株的隔夜預(yù)培養(yǎng)物在LB中按1:100稀釋(ΔN1ΔN2、ΔN1ΔN2ΔN4和Δcco1cco2按1:50稀釋)，并培養(yǎng)至生長中期(500nm時(shí)的OD值為0.5)。用Spectronic 20D+分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific)讀取500nm處的精確OD值，并將培養(yǎng)物調(diào)整至相同的OD值。然后將調(diào)整后的培養(yǎng)物按熒光與非熒光細(xì)胞1:1的比例混合，并將10毫升混合物點(diǎn)在菌落形態(tài)板上，按上述方法培養(yǎng)3天。在指定時(shí)間點(diǎn)收集生物膜，將其懸浮在1毫升1%的胰蛋白胨中，并在珠磨式勻漿器的"高"設(shè)置下進(jìn)行勻漿；第1天的菌落勻漿35秒，第2天和第3天的菌落勻漿99秒。勻漿后的細(xì)胞被連續(xù)稀釋，10-6、10-7和10-8稀釋液被接種到1%的胰蛋白胨平板上，并在37℃下生長過夜。用TyphoonFLA7000熒光掃描儀對(duì)平板成像，確定熒光菌落數(shù)，并確定熒光菌落與非熒光菌落的百分比。

構(gòu)建末端氧化酶報(bào)告程序

使用表1所列引物構(gòu)建了Cco1、Cco2和CcoN4Q4操作子的轉(zhuǎn)譯報(bào)告構(gòu)建體。使用相應(yīng)的引物擴(kuò)增啟動(dòng)子區(qū)域(感興趣的操作子上游500bp)，在啟動(dòng)子的5'端添加一個(gè)SpeI消化位點(diǎn)，在啟動(dòng)子的3'端添加一個(gè)XhoI消化位點(diǎn)。純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)消化后連接到pLD2722載體的多克隆位點(diǎn)(MCS)，即gfp序列的上游。質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株UQ950中，通過測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，并通過與大腸桿菌菌株S17-1的雙親共軛轉(zhuǎn)移到PA14中。PA14單重組子在含100mg/ml慶大霉素的M9最小培養(yǎng)基瓊脂平板(47.8mM Na2HPO4·7H2O、22mM KH2PO4、8.6mM NaCl、18.6mM NH4Cl、1mM MgSO4、0.1mM CaCl2、20mM檸檬酸鈉二水合物、1.5%瓊脂)上進(jìn)行篩選。通過引入pFLP2質(zhì)粒，利用Flp-FRT重組技術(shù)從PA14中分離出質(zhì)粒骨架，并在含有300毫克/毫升羧芐青霉素的M9最小培養(yǎng)基瓊脂平板上進(jìn)行篩選，然后在不含NaCl并改良為含10%蔗糖的LB瓊脂平板上進(jìn)行篩選。最終克隆中g(shù)fp的存在通過PCR進(jìn)行了確認(rèn)。

薄層切片分析

將兩層含1%瓊脂的1%胰蛋白胨分別倒入4.5毫米(下)和1.5毫米(上)深處。過夜前培養(yǎng)物在LB中以1:100稀釋(ΔN1ΔN2、ΔN1ΔN4、ΔN1ΔN2ΔN4、Δcco1cco2以1:50稀釋)并生長2小時(shí)，直至指數(shù)期早中期。然后將5至10毫升亞培養(yǎng)物點(diǎn)在瓊脂表層，將菌落置于25℃黑暗培養(yǎng)條件下，濕度大于90%(PercivalCU-22L)，最多培養(yǎng)3天。在指定的時(shí)間點(diǎn)，將菌落覆蓋在1.5毫米厚的1%瓊脂層上，準(zhǔn)備進(jìn)行薄片切片。將夾在兩層1.5毫米瓊脂層之間的菌落從底層取出，在50mML-賴氨酸磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(pH7.4)中浸泡4小時(shí)(4℃)，然后在4%多聚甲醛、50mML-賴氨酸磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(pH7.4)中固定4小時(shí)(4℃)，再在37℃下過夜。固定的菌落用PBS沖洗兩次，并通過一系列乙醇清洗(25%、50%、70%、95%、3100%乙醇)脫水，每次60分鐘。菌落在Histoclear-II中孵育三次，每次60分鐘，然后在55℃下用100%Paraplast Xtra石蠟分別洗滌兩次，每次2小時(shí)，用蠟浸潤菌落，然后讓菌落在4℃下聚合過夜。使用STP120組織處理器進(jìn)行組織處理。使用自動(dòng)顯微切片機(jī)將修剪好的組織塊切成垂直于菌落平面的10米厚切片，漂浮在45℃的水面上，然后收集到載玻片上。將載玻片風(fēng)干過夜，在45℃的電熱板上熱固定1小時(shí)，然后按相反的處理順序重新水化。將復(fù)水后的菌落立即裝入TRIS緩沖DAPI：Fluorogel中，并蓋上蓋玻片。使用LSM700共聚焦顯微鏡拍攝微分干涉對(duì)比(DIC)和熒光共聚焦圖像。每個(gè)菌株都以這種方式制備了至少三份生物樣本。

菌落厚度測(cè)量

按上述方法制備菌落薄片，但在生長培養(yǎng)基中添加40毫克/毫升剛果紅染料和20毫克/毫升庫馬西藍(lán)染料。利用Fiji圖像處理軟件從共聚焦DIC圖像中獲得菌落高度測(cè)量值。

凝集素染色

按上述方法制備兩天大的菌落進(jìn)行薄片切片。將復(fù)水后的菌落用100mg/ml熒光素標(biāo)記的紫藤凝集素(VectorLaboratories(Burlingame,CA)FL-1351)在PBS中染色，然后用PBS沖洗兩次，用TRIS緩沖的DAPI裝片并覆蓋蓋玻片。使用LSM700共聚焦顯微鏡(Zeiss)拍攝熒光共聚焦圖像。

生物膜的氧化還原分析

使用25μm尖端的氧化還原微電極和外部參比電極(Unisense RD-25和REF-RM)來測(cè)量第2天(約48小時(shí))生物膜(與菌落生物膜形態(tài)測(cè)定一樣)的細(xì)胞外氧化還原狀態(tài)。氧化還原微電極測(cè)量的是樣品相對(duì)于參比電極吸收或釋放電子的趨勢(shì)，參比電極與樣品生長在相同的介質(zhì)中。氧化還原微電極根據(jù)制造商的說明進(jìn)行校準(zhǔn)，采用pH4緩沖液中1%喹啉酮和pH7緩沖液中1%喹啉酮的兩點(diǎn)校準(zhǔn)法。使用微機(jī)械手(Unisense)在整個(gè)生物膜深度每隔5μm測(cè)量一次氧化還原，測(cè)量時(shí)間為3秒，兩次測(cè)量之間的等待時(shí)間為5秒。使用萬用表(Unisense)和Sensor Trace曲線軟件(Unisense)記錄曲線。

生物膜的氧剖面分析

使用25μm尖端的氧微量傳感器(Unisense OX-25)測(cè)量生物膜生長頭2天內(nèi)的氧濃度。在對(duì)生長3天的菌落進(jìn)行氧氣分析時(shí)(圖4)，生物膜的生長過程與薄片分析相同。為了校準(zhǔn)氧氣微電極，使用了兩點(diǎn)校準(zhǔn)法。首先使用校準(zhǔn)室(Unisense CAL300)將氧微傳感器校準(zhǔn)為大氣中的氧氣，校準(zhǔn)室中裝有持續(xù)冒著氣泡的水。然后，使用充入N2的缺氧水溶液將微傳感器校準(zhǔn)到"零"點(diǎn)；為確保完全去除所有氧氣，在將微傳感器校準(zhǔn)到零校準(zhǔn)點(diǎn)之前，向校準(zhǔn)室充入N2至少30分鐘。然后在生物膜的整個(gè)深度進(jìn)行氧氣測(cè)量，測(cè)量時(shí)間為3秒，兩次測(cè)量之間的等待時(shí)間為5秒。對(duì)于6個(gè)生長期的菌落，整個(gè)菌落的剖面步長為1μm；對(duì)于12小時(shí)和24小時(shí)的菌落，步長為2μm；對(duì)于48小時(shí)的菌落，步長為5μm。使用微型機(jī)械手(Unisense MM33)在生物膜內(nèi)移動(dòng)微型傳感器，并使用萬用表(Unisense)和Sensor Trace曲線軟件(Unisense)記錄曲線。

吩嗪定量

將過夜的預(yù)培養(yǎng)物以1:10的比例在LB中稀釋，然后點(diǎn)在一個(gè)25毫米的過濾盤上(孔徑：0.2μm)，過濾盤放置在一個(gè)35×10毫米的圓形培養(yǎng)皿中央。菌落在濕度大于90%的25℃黑暗環(huán)境中生長2天。生長2天后，將每個(gè)菌落(連同過濾盤)從各自的培養(yǎng)皿中取出并稱重。然后在5毫升100%甲醇中過夜提取瓊脂培養(yǎng)基中排出的酚嗪類類化合物(在黑暗中，室溫下進(jìn)行)。然后用0.22μm纖維素Spin-X柱過濾300μl過夜酚嗪類/甲醇提取液，并將200μl流出液裝入高效液相色譜瓶。如前所述，使用高效液相色譜法(Agilent 1100 HPLC系統(tǒng))對(duì)酚嗪類類化合物進(jìn)行定量。

線蟲致病性(慢殺)試驗(yàn)

慢速殺滅試驗(yàn)按前述方法進(jìn)行。簡單地說，將10μl過夜PA14培養(yǎng)物(如上所述生長)點(diǎn)到慢殺瓊脂平板上(0.3%NaCl、0.35%Bacto-Peptone、1mM CaCl2、1mM MgSO4、5mg/ml膽固醇、25mM KPO4、50mg/ml FUDR、1.7%瓊脂)，平板在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)，然后在室溫(~23℃)下培養(yǎng)48小時(shí)。將幼蟲期4(L4)的線蟲挑到PA14種子平板上，并對(duì)活蟲/死蟲進(jìn)行長達(dá)四天的計(jì)數(shù)。每個(gè)平板被視為一個(gè)生物重復(fù)，起始樣本量為30-35條線蟲。