摘要缺氧（hypoxia）是細菌在宿主定植過程中面臨的常見挑戰，部分原因是形成了密集聚集的群落（生物膜）。cbb3型細胞色素c氧化酶，催化呼吸作用的終末步驟并具有高氧親和力，已被認為與細菌致病性相關。假單胞菌屬不同尋常之處在于它們通常包含多個完整和部分（即“孤兒”）的cbb3型氧化酶和氧化酶亞基操縱子。在此，我們描述了孤兒催化亞基CcoN4在機會性病原體銅綠假單胞菌PA14菌株的菌落生物膜發育和呼吸作用中的獨特作用。我們還發現，CcoN4有助于還原吩嗪（phenazines）——一種在生物膜中支持細胞氧化還原平衡的抗生素，并有助于在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）感染模型中的毒力。這些結果突顯了菌落生物膜模型與致病性的相關性，并強調了cbb3型氧化酶作為治療靶點的潛力。

引言

在可用于生物還原的氧化劑中，分子氧（O2）提供最高的自由能產量。自從O2在大約24億年至5.4億年前在大氣中積累以來（Kirschvink and Kopp,2008;Dietrich et al.,2006b），能夠利用它生長和生存并耐受其有害副產物的生物已經進化以利用這種能量并增加了復雜性（Knoll and Sperling,2014;Falkowski,2006）。在小尺度和擁擠的環境中，O2的快速消耗導致對該資源的競爭，并促進了細菌和古細菌的O2還原機制多樣化，而這種多樣化在真核生物中沒有發生（Brochier-Armanet et al.,2009）。使細菌能夠呼吸O2的各種酶表現出不同的親和力和質子泵效率，并可能有助于在缺氧生態位中的競爭成功（Morris and Schmidt,2013）。此類環境包括被具有高度農業（Preisig et al.,1996）和臨床（Way et al.,1999;Weingarten et al.,2008）重要性的細菌定植的動植物宿主組織。

機會性病原體銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），一種能夠定植于植物和動物宿主的細菌（Rahme et al.,1995），具有分支的呼吸鏈，具有使用五種經典的末端氧化酶復合物將O2還原為水的潛力：兩種醌氧化酶（bo3（Cyo）和一種氰化物不敏感bd型氧化酶（CIO））和三種細胞色素c氧化酶（aa3（Cox）、cbb3-1（Cco1）和cbb3-2（Cco2））（圖1A）。幾篇關鍵出版物描述了銅綠假單胞菌的末端氧化酶補體，揭示了該生物特有的特征（Williams et al.,2007;Comolli and Donohue,2004;Alvarez-Ortega and Harwood,2007;Arai et al.,2014;Kawakami et al.,2010;Jo et al.,2014）。銅綠假單胞菌的不同尋常之處在于它編碼兩種屬于cbb3型家族的氧化酶。這些酶以其在低O2濃度下相對較高的催化活性以及僅限于細菌域（Brochier-Armanet et al.,2009;Pitcher and Watmough,2004）而著稱。（銅綠假單胞菌的cbb3型氧化酶通常被稱為cbb3-1和cbb3-2；然而，我們將使用‘Cco1’和‘Cco2’來表示這些酶，與其編碼基因的注釋一致。）大多數編碼cbb3型氧化酶的細菌基因組只包含一個此類復合物的操縱子，其在O2限制條件下特異性誘導（Cosseau and Batut,2004）。在銅綠假單胞菌中，cco2操縱子在低O2濃度生長期間被誘導，但cco1操縱子在高水平組成型表達（Comolli and Dono-hue,2004;Kawakami et al.,2010）。

圖1銅綠假單胞菌的呼吸鏈和cco基因及蛋白產物的排列，以及ccoN孤兒基因的系統發育分布。(A)銅綠假單胞菌的分支電子傳遞鏈，包含五個典型的末端氧化酶。(B)cco基因在銅綠假單胞菌基因組中的組織結構。Cco復合物的圖解基于P.stutzeri的Cco結構(PDB：3mk7)。(C)左圖：各細菌門中含有ccoO和N同源物的基因組比例示意圖。由于Chrysiogenetes、Gemmatimonadetes和Zetaproteobacteria支系中只有一個物種含有ccoO和N同源物，因此省略了這些支系。

銅綠假單胞菌末端氧化酶補體的另一個奇特之處在于，在染色體上遠離cco1和cco2操縱子的位置存在編碼“孤兒”cbb3型亞基的基因。雖然染色體相鄰的cco1和cco2操縱子各自包含四個編碼功能性Cco復合物（由N、O、P和Q亞基組成）的基因，但另外兩個部分操縱子ccoN3Q3和ccoN4Q4各自僅包含編碼Q和催化性N亞基的同源基因（圖1B）。ccoN3Q3操縱子的表達在厭氧反硝化條件下被誘導（Alvarez-Ortega and Harwood,2007），并在2%O2下生長期間暴露于亞硝酸鹽時被誘導（Hirai et al.,2016）。在液體培養物中需氧生長期間，ccoN4Q4被氰化物誘導，氰化物在穩定期產生（Hirai et al.,2016）。然而，額外的表達研究表明ccoN4Q4轉錄受氧化還原條件影響，因為該操縱子被O2限制誘導（Alvarez-Ortega and Harwood,2007）并在響應銅綠假單胞菌產生的氧化還原活性抗生素pyocyanin（綠膿菌素）時輕微下調（Dietrich et al.,2006a）。

在最近的一項研究中，Hirai等人表征了銅綠假單胞菌PAO1中含有經典亞基和孤兒亞基組合的cbb3異構體的生化特性和生理作用（Hirai et al.,2016）。在一個缺乏所有需氧末端氧化酶的菌株中，表達任何異構體都賦予利用O2生長的能力，證實含有孤兒N亞基的異構體具有功能。此外，作者發現，在低O2條件下的液體培養物生長期間，ccoN3Q3和ccoN4Q4的產物分別有助于對亞硝酸鹽和氰化物的抗性。雖然這些結果為cbb3異質復合物在液體培養物生長中的作用提供了見解，但含N3和N4的異構體在生物膜生長和致病性中的潛在作用仍有待探索。

生物膜生活方式——細胞在自產基質包裹的密集群落中生長——已被認為與多種系統中感染的確立和持續存在有關（Edwards and Kjellerup,2012;Rybtke et al.,2015）。生物膜發育促進了O2梯度的形成，使得遠離生物膜表面的細胞處于缺氧或無氧條件（Werner et al.,2004）。使用菌落形態分析來研究氧化還原代謝及其與群落行為的關系，我們發現生物膜中細胞的O2限制導致細胞內氧化還原狀態失衡。這可以通過群落形態的改變來緩解，該改變增加了生物膜的表面積與體積比，從而增加了常駐細胞對O2的獲?。↘empes et al.,2014）。對于生物膜中的銅綠假單胞菌細胞，還原力的細胞內積累也可以通過產生和還原內源性抗生素吩嗪來防止，吩嗪介導向遠處可用的氧化劑的胞外電子轉移（Dietrich et al.,2013）。我們發現生物膜特異性的吩嗪產生有助于急性肺感染小鼠模型中的致病性（Recinos et al.,2012），進一步說明了吩嗪介導的氧化還原平衡對于群落中銅綠假單胞菌細胞的重要性。

由于生物膜生活方式固有的O2梯度形成，我們假設銅綠假單胞菌cco操縱子的差異調節影響了它們對生物膜亞區代謝電子流的貢獻。我們評估了各種cbb3型氧化酶異構體在多細胞行為和毒力中的作用。我們的結果表明，含有孤兒亞基CcoN4的異構體可以通過O2和吩嗪還原支持生物膜中的生存，并有助于銅綠假單胞菌在秀麗隱桿線蟲“緩慢致死”感染模型中的致病性。