研究簡(jiǎn)介:乳腺癌是全球最常見的癌癥之一，其治療手段包括手術(shù)、放療和系統(tǒng)化療等。然而乳腺癌的預(yù)后仍面臨挑戰(zhàn)，尤其是對(duì)于發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者。乳腺癌組織抵御細(xì)胞內(nèi)酸化的機(jī)制依賴于通過鈉碳酸氫鹽共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NBCn1/Slc4a7和鈉氫交換蛋白NHE1/Slc9a1的凈酸排泄。NBCn1作為一種乳腺癌易感性蛋白和潛在的治療靶點(diǎn)逐漸受到關(guān)注，而針對(duì)NHE1的靶向治療效果尚不明確。目前已有針對(duì)NHE1的選擇性小分子抑制劑，但針對(duì)NBCn1的抑制劑尚未出現(xiàn)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NHE1的活性與細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)，且NHE1表達(dá)的破壞可減少三陰性乳腺癌的生長(zhǎng)。然而在人類乳腺癌組織中，高NHE1表達(dá)與降低的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)以及某些分子亞型中改善的患者生存率相關(guān)。研究人員通過三種不同的給藥方式（飲水、滲透泵和腫瘤內(nèi)/周圍注射）對(duì)小鼠進(jìn)行卡里柏利處理，以評(píng)估其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。實(shí)驗(yàn)測(cè)量了腫瘤體積、細(xì)胞內(nèi)pH（pHi）、凈酸排泄以及血清和組織間質(zhì)中的代謝物水平等指標(biāo)。本研究探討了卡里柏利（Cariporide）對(duì)ErbB2驅(qū)動(dòng)的乳腺癌生長(zhǎng)的影響。卡里柏利是一種選擇性鈉氫交換蛋白1（NHE1）抑制劑，已知NHE1在乳腺癌細(xì)胞的酸化防御中起關(guān)鍵作用。研究使用FVB/N-Tg(MMTVneu)202Mul/J小鼠模型，該模型通過在乳腺上皮中過表達(dá)ErbB2來模擬人類乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。

Unisense微電極系統(tǒng)的應(yīng)用

Unisense微電極被用于測(cè)量小鼠乳腺腫瘤組織的pH值。小鼠通過腹腔注射麻醉劑（如氯胺酮和甲苯噻嗪）進(jìn)行麻醉，并放置在加熱墊上以保持體溫。通過小切口暴露腫瘤組織，將微電極安裝在微操縱器上，微電極的參考電極放置在腹腔內(nèi)。微電極以1毫米的步進(jìn)逐漸插入腫瘤組織，記錄每個(gè)位置的pH值。測(cè)試到腫瘤組織中最酸性位置的pH值。Unisense微電極精確測(cè)量了腫瘤組織內(nèi)部的pH值，對(duì)于理解腫瘤微環(huán)境的酸堿狀態(tài)至關(guān)重要。腫瘤微環(huán)境的酸堿狀態(tài)與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和對(duì)治療的反應(yīng)密切相關(guān)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

卡里柏利在體外能有效抑制乳腺癌組織的凈酸排泄，但對(duì)穩(wěn)態(tài)細(xì)胞內(nèi)pH（pHi）的影響較小。長(zhǎng)期體內(nèi)給藥卡里柏利通過上調(diào)鈉碳酸氫鹽共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NBCn1的表達(dá)進(jìn)行補(bǔ)償，使pH調(diào)節(jié)更多地依賴于二氧化碳/碳酸氫鹽（CO?/HCO??）機(jī)制，因此對(duì)ErbB2驅(qū)動(dòng)的乳腺癌生長(zhǎng)沒有明顯的影響。卡里柏利在體外能有效抑制乳腺癌組織的凈酸排泄并輕微降低細(xì)胞內(nèi)pH，但在體內(nèi)長(zhǎng)期使用時(shí)，由于NBCn1的上調(diào)和pHi調(diào)節(jié)機(jī)制的改變，卡里柏利對(duì)ErbB2驅(qū)動(dòng)的乳腺癌生長(zhǎng)沒有顯著影響。這一發(fā)現(xiàn)表明，盡管NHE1是一個(gè)有前景的治療靶點(diǎn)，但在實(shí)際應(yīng)用中可能需要考慮其他補(bǔ)償機(jī)制的影響。研究結(jié)果為NHE1抑制劑在乳腺癌治療中的潛在應(yīng)用提供了重要見解，并強(qiáng)調(diào)了在體內(nèi)環(huán)境中評(píng)估藥物效果的復(fù)雜性。

圖1、卡里柏利抑制乳腺癌組織的凈酸擠出，IC為0.18μM。A.從乳腺癌組織中分離并加載pH敏感熒光團(tuán)BCECF的原代類器官的圖像。B-E.在NH預(yù)脈沖實(shí)驗(yàn)期間從初級(jí)類器官測(cè)量的pH值的平均痕量（n=5-8）。卡里柏利以10μM施用。F.從乳腺癌組織和正常乳腺組織中急性分離的原代類器官的靜息穩(wěn)態(tài)pH，并在存在和不存在CO/HCO的情況下進(jìn)行評(píng)估（n=7-8）。通過雙向方差分析比較數(shù)據(jù)，然后進(jìn)行ˇSíd'ak后測(cè)試。G，H.凈酸擠出活性繪制為pH值的函數(shù)（n=7-8）。卡里柏利濃度為10μM。比較了基于最小二乘線性回歸分析計(jì)算的曲線的截距和斜率。當(dāng)暴露于不同濃度的卡立波利時(shí)，在沒有CO/HCO的情況下，NH前脈沖誘導(dǎo)的酸化后，原發(fā)性乳腺癌類器官在平均pH值為6.8時(shí)評(píng)估的凈酸擠出（n=7-9）。

圖2、Cariporide略微降低乳腺癌組織中的穩(wěn)態(tài)pH。A、B、D、E.從乳腺癌組織（A，B）或正常乳腺組織（D，E）中急性分離的pHin原代類器官的平均痕量。在存在（A，D）或不存在（B，E）CO/HCO的情況下施用卡立泊利（10μM），我們報(bào)告了與匹配的載體/時(shí)間對(duì)照（n=4）相比的pH值差異。C，F(xiàn).在存在和不存在CO/HCO（n=4）的情況下，研究了從乳腺癌組織（C）和正常乳腺組織（F）分離的原代類器官中對(duì)10μM卡立泊利應(yīng)用的pH反應(yīng)，并相對(duì)于匹配的載體/時(shí)間對(duì)照進(jìn)行了報(bào)告

圖3、飲用水中提供的卡立泊利不會(huì)影響原發(fā)性乳腺癌的生長(zhǎng)。A）在接受常規(guī)或含卡泊利的飲用水的小鼠的血清中測(cè)量的卡立泊利濃度。測(cè)試了來自4只對(duì)照小鼠（以確認(rèn)測(cè)定特異性）和27只卡立泊利處理的小鼠的隨機(jī)樣本的血清。ND，檢測(cè)不到。B）體內(nèi)腫瘤體積測(cè)量（n=28）。顯示最佳二階多項(xiàng)式函數(shù)，并通過額外的平方和F檢驗(yàn)進(jìn)行比較;P值與對(duì)照。C）死后腫瘤切除后的離體腫瘤體積測(cè)量（n=28）。通過未配對(duì)的雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)比較數(shù)據(jù);P值與對(duì)照。D）圖C的離體腫瘤體積繪制為相應(yīng)測(cè)量的血清卡里泊利濃度的函數(shù)。

圖4、通過滲透微型泵供應(yīng)的卡立泊利不會(huì)影響原發(fā)性乳腺癌的生長(zhǎng)。A)通過滲透微型泵（n=15-16）接受卡立波利或NaCl載體的小鼠血清中測(cè)量的卡立泊利濃度。ND，檢測(cè)不到。B)體內(nèi)腫瘤體積測(cè)量（n=24-25）。顯示最佳二階多項(xiàng)式函數(shù)，并通過額外的平方和F檢驗(yàn)進(jìn)行比較;P值與對(duì)照。C)死后腫瘤切除后的離體腫瘤體積測(cè)量（n=24-25）。D)圖C的離體腫瘤體積繪制為圖A中相應(yīng)血清卡立普利濃度的函數(shù)。通過最小二乘線性回歸分析比較數(shù)據(jù)

圖5、口服但非腸外給藥卡立泊利會(huì)升高血糖濃度。A、B、E、F.通過飲用水（A，B，n=10）或滲透微型泵（E，F(xiàn)，n=8–9）暴露于卡立泊利或載體的小鼠的血清葡萄糖（A，E，E）和乳酸（B，F(xiàn)）和乳酸（B，F(xiàn)）濃度。C、D、G、H.通過飲用水（C，D，n=10）或滲透微型泵（G，H，n=8–9）從暴露于卡立波利或載體的小鼠的乳腺癌和正常乳腺組織中通過微透析取樣測(cè)量的間質(zhì)葡萄糖（C，G）和乳酸（D，H）和乳酸（D，H）濃度。I.用pH敏感微電極（n=9–22）測(cè)量體內(nèi)腫瘤pH值。面板A、B、E和F中的數(shù)據(jù)通過未配對(duì)的雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，在C、D、G和H中通過重復(fù)測(cè)量雙向方差分析后跟ˇSíd'ak后測(cè)，在圖I中通過單因素方差分析后跟Dunnett后測(cè)。P值與相同條件下的對(duì)照。

結(jié)論與展望

乳腺癌組織抵御細(xì)胞內(nèi)酸化的機(jī)制依賴于通過鈉碳酸氫鹽共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NBCn1/Slc4a7和鈉氫交換蛋白NHE1/Slc9a1的凈酸排泄。NBCn1作為一種乳腺癌易感性蛋白和潛在的治療靶點(diǎn)逐漸受到關(guān)注，而針對(duì)NHE1的靶向治療效果尚不明確。目前，已有針對(duì)NHE1的選擇性小分子抑制劑，但針對(duì)NBCn1的抑制劑尚未出現(xiàn)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NHE1的活性與細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)，且NHE1表達(dá)的破壞可減少三陰性乳腺癌的生長(zhǎng)。然而，在人類乳腺癌組織中，高NHE1表達(dá)與降低的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)以及某些分子亞型中改善的患者生存率相關(guān)。在此，我們?cè)u(píng)估了鈉氫交換抑制劑卡里柏利/HOE-642在ErbB2驅(qū)動(dòng)的乳腺癌小鼠模型中的治療潛力。體外實(shí)驗(yàn)顯示，卡里柏利可抑制乳腺癌組織的凈酸排泄（IC50=0.18μM），并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)pH（pHi）的輕微下降。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，研究人員通過口服、滲透泵以及腫瘤內(nèi)和腫瘤周圍注射的方式給藥，以解決卡里柏利口服生物利用度低和代謝快的問題。

長(zhǎng)期體內(nèi)給藥卡里柏利可上調(diào)NBCn1表達(dá)，使pHi調(diào)節(jié)更多地依賴于二氧化碳/碳酸氫鹽機(jī)制，并且對(duì)ErbB2驅(qū)動(dòng)的原發(fā)性乳腺癌的生長(zhǎng)速率無凈影響。卡里柏利也不會(huì)影響乳腺癌組織中的增殖標(biāo)志物。口服卡里柏利會(huì)使血清葡萄糖水平升高約1.5 mM，而通過其他途徑給藥則不會(huì)。卡里柏利在體外可有效抑制乳腺癌組織的凈酸排泄，但對(duì)穩(wěn)態(tài)pHi的影響較小。長(zhǎng)期體內(nèi)給藥卡里柏利通過NBCn1進(jìn)行補(bǔ)償，我們觀察到對(duì)ErbB2驅(qū)動(dòng)的乳腺癌生長(zhǎng)沒有明顯的影響。unisense氫氣微電極通過精確測(cè)量腫瘤組織內(nèi)部的pH值，為評(píng)估卡里柏利對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響提供了關(guān)鍵數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)支持了研究的主要結(jié)論，即卡里柏利在體內(nèi)對(duì)ErbB2驅(qū)動(dòng)的乳腺癌生長(zhǎng)沒有顯著影響。