體內實驗

大鼠的慢性腦葡萄糖代謝不足。研究在兩組大鼠身上進行：對照組(n=16)和每天靜脈注射2-DG 1個月后出現慢性腦葡萄糖代謝低下的大鼠(n=21)。2-DG是一種合成的葡萄糖類似物，可與葡萄糖競爭，通過載體介導運輸進入哺乳動物大腦。它還能競爭性地磷酸化為2-脫氧葡萄糖-6-磷酸，后者不能被磷酸葡萄糖異構酶轉化為6-磷酸果糖，從而抑制糖酵解。直接向大腦注射2-DG會在沒有全身性低血糖的情況下產生局部細胞葡萄糖減少癥，并排除糖酵解抑制對其他器官的潛在負面影響。我們在腦室內注射了2.5μl的2-DG溶液(20mM)(8.2微克)。腦脊液的總體積約為90μl，假定腦脊液中的2-DG擴散速度很快(部分由附膜細胞的纖毛促進)，2-DG的最終濃度為0.56毫摩爾，分布均勻。由于2-DG在大鼠大腦中通過細胞外液(ECF)傳輸到細胞的體積僅為1μl，因此我們可以假設最終ECF中的2-DG濃度也將等于0.56毫摩爾。成年大鼠海馬的ECF葡萄糖濃度約為1.3mM。2-DG和葡萄糖共享相同的膜運輸系統，但糖酵解速率的限制因素是己糖激酶的活性。相對糖酵解率可按下式計算：

U=Umax[Glu]/([Glu]+Km(1+[2-DG]/Ki)

葡萄糖磷酸化的邁克爾常數(Km)為0.07mM，2-DG的抑制常數(Ki)為0.3mM。因此，注射2.5微升20mM 2-DG溶液會導致糖酵解抑制率達到14%。動物以注射0.9%NaCl溶液(2.5微升)作為對照。

靜脈注射藥物4周后，一組大鼠用于LFP記錄和隨后的核磁共振分析，另一組大鼠用于戊四唑(PTZ)測試和體內外實驗。在體外實驗中，在最后一次注射2-DG/vehicle約12小時后提取大腦。

立體定向手術。大鼠在佐萊地爾(24毫克/千克，i.m.)和賽拉嗪(12毫克/千克，i.m.)的靜注麻醉下進行手術。使用漢密爾頓注射器進行靜脈注射給藥時，將導管浸入側腦室(AP=-0.8；L=1.0；H=3.0)。為了記錄海馬LFPs，在同側海馬前部齒狀回區域(AP=-3.6；L=2.0；H=3.6)植入了100微米薄鎳鉻絕緣電極。參比電極被擰入枕骨。實驗開始時間不早于術后一周。用于體外實驗(n=8)和PTZ試驗(n=12)的動物只植入了導引插管。

LFP記錄。自由移動大鼠的LFP被放大、濾波(高通濾波器0.1Hz，數字化頻率5kHz)，并使用DataPack2k軟件(RUN Technologies)進行存儲。實驗方案：在幾天的對照期內記錄LFPs，然后每天服用藥物或2-DG。每只大鼠每3天記錄一次。在整個給藥期間都記錄LFPs。

所有記錄均在清醒、自由活動的動物中進行，這些動物被關在自己的籠子里(以盡量減少狀態變化帶來的壓力)，并被放置在法拉第籠中。每次記錄之前，動物都要經過15分鐘的實驗條件適應期。記錄時間為10：00至15：00。每次實驗的平均持續時間約為2.5小時。在記錄過程中，對動物進行監測和控制，使其保持清醒。進一步分析表明，在不同行為狀態下(如躺臥或漫步)記錄的LFPs沒有明顯差異。這種無差異可能是由于環境因素造成的，例如完全沒有外部刺激(熟悉的小圍欄、孤獨、統一的背景、缺乏食物/飲料、一天中不活動的時間)。因此，在各種行為狀態下記錄的LFPs都集中在一起進行分析。隨后，將大腦在液氮中快速冷凍，用于核磁共振分析。

LFP分析。為了評估高振幅尖峰的數量和持續時間，記錄的標準偏差(SD)是從遠離刺激區域的足夠長的基礎活動期(>3分鐘)中計算出來的。程序掃描蹤跡，在50至990毫秒的持續時間范圍內選擇所有高于等于5 SD的閾值水平的事件。

為了評估超過基礎水平的LFP活動(累積活動)，我們采用了以下步驟：將LFP記錄歸一化為SD，并將閾值設為3 SD。程序掃描蹤跡并選擇所有高于閾值水平的事件。所有負事件均被反轉。之后，程序計算每個連續時間段內的事件峰值總和。由于LFP記錄已歸一化，因此可對每組動物的累積活動進行平均。

為了比較高頻猝發(HFB)事件，該算法掃描了在60到600Hz范圍內過濾的LFP記錄，并選擇了所有超過7 RMS(基線均方根)閾值的事件。從這些事件中，進一步分析在100至250Hz和250至600Hz濾波跡線中超過7 RMS閾值的事件。只有由五個以上振蕩組成的事件才會被考慮進行分析。以前也曾使用過類似的程序。為了檢測和評估自發性癲癇發作，我們使用計算機自動分析LFP記錄，其選擇限制如下：癲癇發作閾值為基線的7 RMS；掃描窗口(5秒)中超過閾值的振蕩次數不少于10；最短癲癇發作持續時間為10秒。

PTZ敏感性測試。為了研究動物對亞驚厥劑量的PTZ(35毫克/千克)的敏感性，我們將動物分為兩組，分別是經空白載體處理的動物(n=6)和經2-DG處理的動物(n=6)。最初，在手術和慢性手術前注射PTZ以測試對照組的反應。在靜注2-DG(或對照用載體)治療4周后，再次注射亞驚厥PTZ。在最后一次注射2-DG/空白載體24小時后進行PTZ測試。根據W.Fischer和H.Kittner的研究，根據行為模式對癲癇發作嚴重程度進行評估。Kittner的研究：無發作(0期)；微弱點頭(0.5期)；耳朵、臉部和眼瞼抽搐(1期)；輕度前肢陣攣(1.5期)；肌陣攣性身體抽搐，前肢陣攣性抽搐(無后仰)(2期)；部分后仰和前肢快速陣攣性發作(2.5)；強力雙側前肢陣攣，伴有完全仰臥(10秒)(第3期)；仰臥和跌倒，伴有強力雙側前肢陣攣(第3.5期)；全身陣攣性發作，伴有仰臥-跌倒發作或跳躍(第4期)；全身陣攣-強直發作，伴有右側反射失敗(第4.5期)；全身陣攣-強直發作和癲癇狀態(2分鐘)(第5期)。

通過核磁共振測量腦代謝物。大鼠的整個頭部在斷頭后被冷凍在液氮中。眾所周知，這種技術能保留部分而非全部易變代謝物，但由于斷頭后的易變代謝物水平取決于自溶而非神經元興奮性，因此檢測到的變化仍能可靠地與已發展的病理狀態相關聯。

完全冷凍后，在-15℃溫度下放置1小時，然后提取、破碎大腦并保存在液氮中。在冷凍樣本中加入等重量的氯仿(CDCl3)和700微升D2O，在振動器中用玻璃球勻漿30秒，然后在15000g轉速下離心5分鐘。在540μl上清液中加入60微升4μM的3三甲基硅基[2,2,3,3-2H4]丙酸酯(TSP)D2O溶液，攪拌后放入NMR管中。1D和2D COSY圖譜是在一臺AVANCE III 600 NMR光譜儀上記錄的，該光譜儀使用標準脈沖序列，質子頻率為600MHz，管徑為5毫米，溫度為298°K。通過使用ZGPR 1D脈沖序列進行預飽和，實現了水抑制。采集次數為128次掃描，掃描間隔為10秒，足以滿足所有觀察到的代謝物的質子弛豫。在3.41秒內對96個K點進行了自由誘導衰變登記，光譜寬度為24ppm，90°脈沖為11μsec，并在填充零點后對128個K點進行了傅里葉變換。化學位移的校準是以0.00ppm的TSP信號作為內部參考。二維COSY序列COSYGPPRQF被用于細化峰值分配。利用布魯克公司"AMIX"軟件的光譜數據庫以及公共數據庫HMDB(人類代謝組數據庫)對核磁共振光譜中的所有重要信號進行了識別，并將其分配給代謝物。針對核磁共振光譜中最重要的信號，計算了大鼠大腦中代謝物的相對濃度(即總可溶性化合物的分數)。為便于展示，將每種代謝物濃度歸一化為個體最小值與最大值之差(%max-min)，并繪制成組均值±SEM。光譜處理和積分計算由布魯克公司的"TOPSPIN"程序進行。