摘要

在致癇組織中發現的代謝異常提供了大量腦代謝不足的證據，而獲得性癲癇的主要風險因素都以腦代謝不足為共同結果，這表明腦能量平衡的破壞實際上可能先于癲癇的發生。然而，腦能量代謝不足與癲癇發病之間的因果關系尚未確立。為了解決這個問題，我們通過每天腦室內注射不可代謝的葡萄糖類似物2-脫氧-D-葡萄糖(2-DG)，建立了一個慢性能量代謝低下的體內模型，并研究了2-DG對細胞水平的急性影響。在海馬切片中，2-DG的急性糖酵解抑制(約35%)會對網絡產生截然不同的影響：興奮性突觸傳遞下調，神經元靜息電位去極化，抑制性傳遞驅動力下降。因此，2-DG對神經網絡興奮性的潛在急性效應取決于突觸前后這些對立變化之間的平衡。在體內，我們發現在最初健康的雄性大鼠中，長期靜脈注射2-DG(估計對腦糖酵解的瞬時抑制率為14%)4周后會誘發癲癇樣活動。我們的研究結果表明，大腦能量代謝的長期抑制是后天性癲癇風險因素的特征，特別是葡萄糖利用率的降低(通常在癲癇患者中觀察到)可以啟動癲癇的發生。

意義

后天性癲癇發病的確切機制尚未完全明了。目前已發現多種風險因素，如腦外傷、感染和中風，所有這些因素都會導致腦代謝不足。同時，在癲癇患者中也觀察到葡萄糖消耗不足。我們發現，長期抑制健康大鼠大腦的葡萄糖消耗會導致癲癇。我們的研究結果表明，腦代謝不足不僅僅是疾病的副作用，而是后天癲癇的主要誘發因素。

引言

能量代謝紊亂與癲癇發生的關系已被廣泛接受，但能量產生過程與神經元過度活躍之間的確切機理聯系和因果關系仍在研究之中。重要的是，代謝不足(在人類中表現為腦部葡萄糖消耗減少)是后天性癲癇的一個主要因素。然而，一種流行的研究趨勢認為，抑制能量代謝可能會產生有利的抗癲癇效果。這種想法主要基于低碳水化合物、高脂肪生酮飲食(KD)的效果，這是臨床上唯一接受的治療難治性小兒癲癇的代謝干預方法；KD用酮體部分替代葡萄糖作為線粒體燃料的一個推測結果是抑制糖酵解，因此許多試圖復制KD核心治療效果的研究特別關注糖酵解抑制的潛在抗癲癇作用。例如，據報道，服用糖酵解抑制劑2-脫氧-D-葡萄糖(2-DG)或乳酸脫氫酶抑制劑可產生急性抗癲癇作用。然而，慢性糖酵解停滯是否會復制這些結果尚未得到闡明。與此同時，在致癇組織中發現的代謝異常提供了大量腦代謝低下的證據，并表明腦能量平衡的破壞實際上可能先于癲癇的發生。因此，試圖抑制腦糖酵解存在潛在危險，因為這可能只會進一步加劇現有的代謝危機。必須解決的重要問題是腦代謝不足與癲癇發生之間的因果關系--換句話說，能量危機本身是否是癲癇發生的啟動和驅動因素，還是僅僅是過度活動的結果。為了解決這個問題，我們開發了一種體內慢性能量代謝低下模型，每天腦室內注射2-DG。我們發現，在最初健康的大鼠體內長期注射2-DG會誘發癲癇樣活動，這表明抑制腦糖酵解是癲癇的誘發因素，并突出了此類治療策略的風險。

材料與方法

動物

九只OF1雄性小鼠用于腦切片急性實驗。對37只成年Sprague-Dawley雄性大鼠進行了慢性實驗。實驗開始時，小鼠體重約為30至40克，大鼠體重約為220克。動物被飼養在單獨的籠子里，光/暗周期為12：12小時，食物和水自由供應。所有實驗均在10：00至15：00之間進行。在整個試驗過程中都會監測動物的體重。

切片實驗

腦切片準備。迅速將大腦從頭骨中取出，放入冰冷的ACSF中。ACSF溶液包括(以毫摩爾為單位)NaCl 126、KCl 3.50、NaH2PO4 1.25、NaHCO3 25、CaCl2 2.00、MgCl2 1.30和葡萄糖5，pH值為7.4。ACSF用95%O2/5%CO2混合氣體充氣。使用組織切片機切割矢狀切片(350μm)。切片過程中，切片浸沒在冰冷(<6℃)的溶液中，溶液成分為(以毫摩爾計)K-葡萄糖酸140、HEPES 10、Nagluconate 15、EGTA 0.2、NaCl 4，pH值用KOH調節至7.2。切片被立即轉移到一個不斷循環ACSF的多節雙側灌注保溫箱中，并在室溫(22℃-24℃)下恢復2小時。

單細胞電生理學(Em和EGABA測量)。對于細胞附著單通道記錄：NMDA受體電流的反向電位接近0mV；因此，在細胞附著記錄中，測量NMDA電流的反向電位可得出靜息膜電位(Em)的值。同時，GABA受體電流反向電位的測量提供了GABA誘導電流的驅動力。單通道記錄使用含有(以毫摩爾為單位)(1)的移液管溶液進行，以記錄單個GABA通道：NaCl 140、KCl 2.5、CaCl2 2、MgCl2 1、HEPES 10、GABA 0.01，pH值用NaOH調節至7.3；(2)用于記錄單個NMDA通道：NaCl 140，KCl 2.5，CaCl2 2，HEPES 10，NMDA 0.01，甘氨酸0.01，用NaOH調節pH值至7.3。在急性期(無知覺動物)應用2-DG的情況下，切片在含有5mM葡萄糖和7mM 2-DG的ACSF中的蒸汽界面保持室中培養至少1小時，然后轉移到灌注相同溶液的浸沒式記錄室中。在5mM葡萄糖存在的情況下，7mM 2-DG應能抑制約35%的葡萄糖轉運進入細胞；對照組切片自始至終保持在5mM葡萄糖ACSF中。然后，按照之前的描述，在局部施加GABA脈沖的情況下，通過gramicidin-patch記錄測量GABA介導的電流(EGABA)的電位和反向電位。

突觸刺激和場電位記錄。使用帶有雙極金屬電極的DS2A隔離刺激器刺激Schaffer側支/神經叢或穿孔路徑。使用單脈沖(40-170μA，200μsec，0.15赫茲)調節刺激電流，以誘發約50%最大振幅的局部場電位(LFP)。用玻璃微電極記錄LFP，微電極中注入ACSF，置于金字塔層或顆粒細胞層，并連接至ISODAM-8A放大器。在進行對照記錄后，在添加2-DG 40分鐘后記錄LFPs。突觸刺激包括以10Hz頻率持續10秒的刺激序列(200微秒脈沖)。在低葡萄糖反應衰減實驗中，用10mM葡萄糖ACSF灌注切片，并以10秒的間隔用恒定電流刺激(0.2毫秒，最高0.3毫安)發出測試脈沖，誘發相當于最大反應50%的LFP反應。在記錄至少10分鐘的穩定基線后，用改良的0.1mM葡萄糖ACSF誘導切片進行葡萄糖剝奪至少60分鐘。測量誘發的LFP響應積分，并與基線值歸一化。

NAD(P)H熒光成像。NADPH和NADH具有相似的光學特性；因此，預計NADPH可能會對總的自發熒光信號有所貢獻。使用290-370納米的激發濾光片和420納米的長通濾光片監測海馬切片中NAD(P)H熒光的變化。光源是配備汞弧燈的Intensiligh C-HGFI照明器。切片通過尼康直立顯微鏡(配備4×/0.10尼康物鏡)進行外延照明和成像。使用線性冷卻型12位CCD相機采集圖像，數字空間分辨率為640×480。由于熒光發射水平較低，NAD(P)H或FAD圖像以8×8分檔圖像的形式每600至800毫秒采集一次(有效空間分辨率為80×60像素)。對曝光時間進行調整，以獲得介于2000至3000光強水平(動態范圍的50%)之間的基線熒光強度。使用ImageJ軟件(NIH)測量LFP和pO2記錄點附近三至五個感興趣區的輻射層熒光強度變化。數據以熒光相對于基線變化的百分比[(ΔF/F)100]表示。由于不同實驗的熒光強度不同，因此使用氧化與還原(浸透-過沖)比率來平均和確定2-DG的能量代謝效應。

氧氣、葡萄糖和乳酸鹽測量。使用克拉克式氧微電極(尖端直徑10微米；Unisense)測量切片組織的pO2，電極連接到皮米計(Unisense)上。組織葡萄糖和乳酸濃度用酶微電極(尖端直徑25微米)測量。第一次極化后進行校準，每次實驗后重復校準。在分析中，耗氧量按低于基線的pO2瞬態積分估算。