圖5生物過程基因本體注釋分析與電子傳遞鏈和TCA循環途徑。A，與生物過程相關的基因本體注釋分析的二維氣泡圖。圖中顯示了主要生物過程(圓圈)與外泌體中發現的蛋白質經FDR校正后的-Log10P值的對比圖。圓圈的大小和顏色與每個生物過程相關蛋白質的數量成正比。B，在電子傳遞鏈和TCA循環途徑中，用紅色標出外泌體中富集的該生物過程的蛋白質，用淺灰色標出在文獻尿液外泌體中發現的蛋白質。

在外泌體中發現的蛋白質具有特定的多樣性，這可能意味著這些蛋白質具有不同的功能。為了評估這一點，我們使用細胞圖譜軟件進行了基于生物過程注釋的基因本體分析。外泌體的生物過程中至少有20%的相關基因，且經FDR校正后P≤0.05的值被認為是顯著的。基因本體分析確定了384個重要的頂級基因特征(數據未顯示)。圖5顯示了生物過程基因本體注釋分析的二維氣泡圖，突出顯示了尿液外泌體中存在的主要生物過程。這些過程包括：運輸、免疫系統過程、細胞分化、細胞運動、細胞粘附、細胞骨架組織、囊泡運輸、細胞凋亡調控、蛋白水解、組織相關miRNA含量和新陳代謝。事實上，有趣的是，大多數基因名稱特征與氧化代謝有關，其中葡萄糖代謝顯著豐富，從而包括TCA循環和呼吸電子鏈(圖5A)。特別是，TCA循環酶(ACO2是唯一的例外)和103個呼吸鏈蛋白中有34個被鑒定出來。盡管如此，如圖5B所示，這34個蛋白質代表了所有五種呼吸鏈復合物。

圖6尿液外泌體的耗氧量和ATP合成。A顯示了尿液外泌體中氧氣消耗。加入0.7mM NADH可刺激由復合物I、III和IV形成的途徑。為了抑制這一途徑，加入了40μM的魚藤酮(復合物I的抑制劑)。然后，為了誘導由復合物II、III和IV組成的途徑，加入20mM丁二酸，并使用50μM抗霉素A(復合物III的抑制劑)來停止反應。耗氧量以μM O2表示。B是與NADH或琥珀酸的耗氧量比較。數據以nmol O/min/mg表示。

這些意想不到的發現表明，尿液外泌體特別富含有氧代謝蛋白質，因此我們開始評估這些蛋白質在氧化磷酸化(OXPHOS)過程中是否活躍。為了評估這一點，我們評估了尿液外泌體的耗氧量和ATP合成。實驗是在沒有去污劑的情況下進行的，以檢測表面的OXPHOS。圖6A顯示了尿液外泌體呼吸作用圖，在加入NADH誘導由復合物I、III和IV組成的呼吸途徑，或加入琥珀酸激活由復合物II、III和IV組成的呼吸途徑之后，尿液外泌體的呼吸作用發生了變化。之所以選擇NADH作為呼吸底物，是因為它有助于區分線粒體呼吸和線粒體外呼吸(我們之前已經證明了這一點)，因為它對作為呼吸底物的離體線粒體無滲透性。圖6A顯示，尿液外泌體消耗氧氣的方式分別受到復合體I和III抑制劑魚藤酮和抗霉素A的抑制。有趣的是，存在琥珀酸時的呼吸速率高于存在NADH時的呼吸速率，這也如圖6B所示。這證實了耗氧量不是由于線粒體污染造成的，因為在這些細胞器中，復合體I、III和IV的途徑通常比復合體II、III和IV組成的途徑更有效。為了評估尿液外泌體中的耗氧量是否最終轉化為ATP合成，我們在NADH存在下檢測了ATP合成活性。ATP合成在反應的前2分鐘呈線性(數據未顯示)。P/O比約為2.4±0.3，表明氧消耗與ATP合成相關聯。

圖7外泌體蛋白質二維電泳圖譜。A，外泌體總蛋白的代表性銀染色；B，生物素化的外泌體表面蛋白；C，ATP5B的Western印跡檢測。用抗ATP5B檢測FoF1-ATP合酶beta亞基后觀察到的斑點與觀察生物素化外泌體蛋白后觀察到的一些斑點重疊，表明這些斑點代表了外泌體表面特異表達的一種蛋白。

為了證實呼吸電子鏈復合物在外泌體表面表達，我們使用EZ-linksulfo-NHS-LC-LC生物素酯對膜表面蛋白進行化學共軛，并對呼吸電子鏈復合物中的一個蛋白即ATP合成酶β亞基(ATP5B)進行了免疫檢測。EZlinksulfo-NHS-LC-LC生物素酯是一種細胞滲透性氨基反應劑，廣泛用于標記暴露在活細胞表面的蛋白質。此外，生物素與中性印跡蛋白的結合是已知最強的非共價相互作用之一，是使用HRP結合物中性印跡蛋白特異性檢測生物素化蛋白質的有力工具。因此，只有那些暴露在表面并被生物素標記的蛋白質才會被揭示出來。在這里，生物素化的外泌體被裂解并通過二維凝膠電泳(2-DE)分離。將等量的裂解液轉移到硝酸纖維素膜上，用HRP連接的中性葡萄蛋白檢測，并與銀染色的相同裂解液進行比較。通過比較總蛋白圖譜(圖7A)和生物素化蛋白圖譜(圖7B)，可以發現蛋白質的數量和組成存在很大差異。這一結果與外泌體表面蛋白生物素化的高度特異性是一致的。

此外，在檢測抗-ATP5B后獲得的同一裂解液圖像(圖7C)中也出現了一個斑點，其位置與生物素化外泌體蛋白可視化后觀察到的位置相同，這表明這些斑點代表了特異性存在于外泌體表面的蛋白質種類。

4討論

測定健康尿液的蛋白質組成可加深對腎臟生理的了解，并建立一個數據庫，用于比較正常尿液和各種腎臟疾病患者的尿液。在本研究中，為了進一步加深對健康尿液蛋白質組的了解，我們使用了12份尿液樣本來鑒定水溶性尿瘤(2473個蛋白質)和外泌體(1951個蛋白質)的蛋白質組成。采用的方法是順序取樣法，這種方法可以生成尿液蛋白質組圖譜，該圖譜由子餾分構建，突出了具有不同化學物理特性的蛋白質，如高度疏水性蛋白質(沉淀餾分)、微弱蛋白質(珠子餾分)和來自不同納米囊泡的蛋白質(外泌體餾分)。這樣還可以將尿瘤體與其外泌體進行比較。盡管樣品制備技術需要更多的工作和時間，但CPLL-bead處理方法發現了大部分新鑒定的蛋白質，證實了發現階段的實用性，有助于生成健康的尿液蛋白質數據庫。

為了更好地了解兩種樣本之間蛋白質表達的差異，我們將尿液收集對象限定為年齡在35-45歲之間的健康捐獻者，從而減少了生物變異；由于尿液蛋白質組會隨時間發生明顯變化，我們還收集了相同的尿液(第二次晨尿)。此外，考慮到觀察到的生物變異，我們收集了足夠的簡單樣本量，以確定尿瘤和外泌體之間有統計學意義的兩倍變化，P=0.05，功率為80%。

在我們之前的研究中，我們利用兩個第二晨尿集合樣本，在四個水溶性組分中鑒定出2251個蛋白質，在外泌體組分中鑒定出1615個蛋白質。在本研究中，我們在每個組分中鑒定出的蛋白質數量與本研究和之前的其他研究相當。通過統計學和生物信息學分析，我們在尿瘤和外泌體部分之間發現了兩個不同的樣本群，其內部同質性很高。外泌體表達的779個蛋白質與人類尿液外泌體數據庫重疊，1615個蛋白質與之前的文獻數據重疊。因此，在我們的研究中鑒定出的蛋白質中有83%是人類外泌體的已知成分，這證實了本研究對尿液外泌體進行了充分的分離。大多數外泌體蛋白為細胞質或膜蛋白，少數為細胞外蛋白。這一結果似乎并不令人驚訝，因為這些納米囊泡在形成和排泄過程中會吸收細胞質中的蛋白質和微核糖核酸。

此外，外泌體蛋白質組分析表明，蛋白質圍繞特定功能聚集。特別是，本研究報告了外泌體的一個有趣特征，即這些外泌體表達與代謝功能相關的蛋白質。我們以前曾對這一事實進行過研究，認為外泌體中表達的與新陳代謝相關的蛋白質可能是功能性的。實驗數據表明，通過蛋白質組學對尿液外泌體中表達的蛋白質進行統計分析后得出的預測是可靠的。此外，顯示尿液外泌體中有氧呼吸過程功能的數據與人類臍帶胚胎間充質干細胞外泌體的數據一致。外泌體獨立于線粒體進行有氧呼吸，而線粒體從未接觸過中微粒體。深入研究表明，間充質干細胞和尿液中的外泌體代表了從本體到廢液的連續統一體的兩個極端，這表明進行有氧呼吸的能力可能是外泌體的共同特征，進一步的研究可能會證實這一點。

組裝線粒體ETC復合物需要復雜的導入和折疊機制，很難設想外泌體也有這種機制。相反，由于外泌體的生物生成過程從未與線粒體接觸過，因此外泌體所產生的MVB很可能吸收了線粒體內膜的蛋白質。考慮到OXPHOS機器是在線粒體中組裝的，形成了一種被稱為超級復合物的超微結構，我們假設這種超分子結構由于線粒體和內質網的異源融合而轉移到了外泌體中。值得注意的是，線粒體和內質網之間的聯系并不新鮮。一些研究報告稱，這兩個細胞區室之間存在磷脂交換。支持這一觀點的事實是，線粒體在細胞中形成了一個動態網絡，盡管線粒體被認為是一個半獨立的動力室，但它們與細胞的其他部分相連，可以進行新陳代謝交換和交流。有人研究了線粒體和ER通過特定蛋白質(稱為MAM(線粒體相關膜))的相互作用。

這一網絡似乎是維持細胞平衡、生物能和存活的基礎，最終決定了細胞在應激條件下的命運。在過去的幾年中，我們中的一些人描述了一些組織中異位OXPHOS的活動，這些活動是由線粒體中的相同蛋白質執行的。此外，其他作者也報告了OXPHOS的異位功能表達。進一步的研究可能會評估我們報告的外泌體代謝活動的生理意義。

尿液是一種具有挑戰性的環境，但我們還是分離出了保留其特殊蛋白質成分的外泌體。分離方法反過來又會對分離出的外泌體的完整性產生重大影響。尿液外泌體蛋白質組分析的額外分離步驟可通過不同的分離程序實現。我們這里采用的超速離心法被認為是分離外泌體的首選方法，也是純化外泌體用于分離后分析的最常用方法。

數據表明，尿液蛋白質互補研究將受益于對外泌體的關注，因為外泌體的蛋白質比總尿液中的蛋白質保存得更有效。尿液及其外泌體有一個顯著的優勢，即可以通過非侵入性或微侵入性的方式輕松獲取，其數量原則上不受限制。另一個優勢是可以搜索生物標記物的表達，即可以識別其來自腎臟系統細胞的蛋白質。事實上，大多數尿液蛋白質都包含在囊泡中。發現腎衰竭的早期標志物尤為重要，因為大多數腎臟疾病的臨床表現都較晚。外泌體可能濃縮了可通過免疫分離的生物標志物。此外，對分離出的外泌體中的RNA含量進行研究也可作為一種診斷工具：例如，有報告稱這可用于癌癥診斷。

5總結

總之，我們為了解健康尿液蛋白質組的各種成分做出了貢獻，繪制了人類健康尿瘤與外泌體相比的詳細蛋白質組圖譜。此外，我們的外泌體蛋白質組圖譜顯示，這些蛋白質聚集在特定功能周圍，其中一個功能與有氧代謝有關。數據顯示了尿液外泌體中呼吸鏈復合物和TCA循環酶的功能表達。