摘要

外泌體是大多數(shù)細(xì)胞類型在多囊內(nèi)體與質(zhì)膜融合后釋放的40-100納米的囊泡。外泌體在包括尿液在內(nèi)的體液中無處不在，含有來源組織特有的蛋白質(zhì)和RNA。尿液中的外泌體作為一種很有前景的疾病生物標(biāo)志物庫，已被廣泛研究。

在這里，我們報(bào)告了通過Orbitrap質(zhì)譜對尿液外泌體與尿瘤進(jìn)行比較的蛋白質(zhì)組分析。我們對樣本采用了一種發(fā)現(xiàn)方法。共發(fā)現(xiàn)3429種蛋白質(zhì)，外泌體和尿瘤之間的重疊極少。外泌體中的959個蛋白質(zhì)(28%)和尿瘤中的1478個蛋白質(zhì)(43%)只存在于一組中。通過細(xì)胞圖譜分析，生物過程基因本體與其功能性概率相關(guān)(P≤0.05)。這是以前從未研究過的，結(jié)果表明這些外泌體在新陳代謝功能，特別是有氧ATP生產(chǎn)功能方面具有顯著的聚集性。尿液外泌體進(jìn)行氧化磷酸化，能夠合成ATP并消耗氧氣。

人類尿液外泌體作為生物活性囊泡消耗氧氣來有氧合成ATP，其功能是以前未曾想到的。正常人尿液蛋白質(zhì)組的測定有助于建立健康尿液蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫供比較，對各種腎臟疾病很有幫助。

生物學(xué)意義：所報(bào)告的研究結(jié)果代表了在了解健康人體尿液蛋白質(zhì)組方面取得的重大進(jìn)展。利用收集的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析的方法可以評估尿液外泌體與尿瘤的獨(dú)特組成，并闡明前者中存在以前未知的分子通路。由于尿液外泌體的新陳代謝能力具有生物學(xué)意義，可能代表了其重要的一般特征，因此該論文有可能對其研究領(lǐng)域產(chǎn)生影響。

1引言

細(xì)胞會釋放各種膜囊泡，其中包括外泌體。外泌體目前以其大小和膜成分為特征。外泌體從內(nèi)體(多泡體，MVB)中萌發(fā)，內(nèi)體可以與溶酶體融合，也可以在多泡體與質(zhì)膜融合后分泌。純化的外泌體不含血清蛋白或細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器(如線粒體)的蛋白質(zhì)成分，因?yàn)榫€粒體在其生物生成過程中從未與外泌體接觸過。在外泌體中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)中，有許多不僅是參與多核生物體生物生成的機(jī)制的一部分，也是其來源細(xì)胞的一部分。所有體液(其中包括血漿、母乳和尿液)都含有外泌體。研究表明，人體尿液中的外泌體來自泌尿道和腎臟的各類細(xì)胞。由于尿液外泌體能夠攜帶來自腎臟的信息，也可能通過血液攜帶來自全身的信息，因此人們對尿液外泌體的興趣與日俱增。

通過幾種蛋白質(zhì)組學(xué)分析方案分析了不同來源外泌體的蛋白質(zhì)含量。外泌體尿液蛋白質(zhì)組已經(jīng)編目。外泌體還富含脂質(zhì)(膽固醇、鞘脂、磷脂)。外泌體的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)組成與其生物生成有關(guān)。外泌體的RNA含量(其中包括miRNA)尤其重要，它可以傳遞遺傳信息。造成外泌體蛋白質(zhì)和RNA組成的分選信號尚不清楚。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著積極作用。

尿液外泌體可抑制大腸桿菌的生長。事實(shí)上，尿液外泌體可被視為泌尿道內(nèi)宿主防御的先天性免疫效應(yīng)因子之一。由于外泌體易于獲取，因此被認(rèn)為是腎臟疾病和損傷生物標(biāo)志物的潛在來源。

干細(xì)胞外泌體的一項(xiàng)有趣功能引起了研究人員的注意。研究表明，外泌體或分泌外泌體的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)可以挽救受傷細(xì)胞的有氧代謝，因此有人提出將外泌體用于再生醫(yī)學(xué)。缺血細(xì)胞會迅速喪失ATP和NAHD含量，而間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體能在極短的時間內(nèi)(約1小時)恢復(fù)ATP和NAHD含量，從而排除了DNA合成的參與。通過比較尿液外泌體、非尿液外泌體和尿瘤的蛋白質(zhì)組，我們發(fā)現(xiàn)許多已鑒定的蛋白質(zhì)都與有氧代謝功能有關(guān)，具有很高的功能性。有趣的是，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體有能力進(jìn)行氧化磷酸化。

為了進(jìn)一步研究外泌體的生物能作用，我們通過蛋白質(zhì)組分析對外泌體進(jìn)行了分析。我們還將外泌體蛋白質(zhì)組與尿瘤進(jìn)行了比較。

2材料與方法

2.1尿液收集和分餾

在征得知情同意后，收集12名健康捐獻(xiàn)者(6男6女)的第二次晨尿，并按照標(biāo)準(zhǔn)方案(見EuroKUP-European Kidney和尿液蛋白質(zhì)組學(xué)網(wǎng)站)立即在4℃下以1000g離心10分鐘以去除細(xì)胞碎片。上清液分為兩份。第一份用水透析并凍干，得到未經(jīng)處理的部分。第二份上清液在JA-20轉(zhuǎn)子(BeckmanAvanti?J-25)中以17000g離心75分鐘，溫度為16℃，以去除尿液中的微小顆粒沉淀物。上清液在Ti90轉(zhuǎn)子(BeckmanOptima?l-90K)中以100000g、18℃超速離心75分鐘，以分離外泌體囊泡。顆粒在PBS中洗滌三次，最后在DTT(100mg/mL)和Tris-HCl 65mM pH8.8中洗滌，以去除尿液樣本中的蛋白質(zhì)，然后在16000g下于4℃離心10分鐘。

100000g的上清液與水進(jìn)行透析；50mL的等分液加入100μL的醋酸(pH值約為3-4)和10mL的正丁醇，然后在18℃下以3000g離心10分鐘。得到三個不同的階段：蛋白質(zhì)顆粒(沉淀部分)、上清液和色素(棄掉)。

在ProteoMiner?色譜法中，將有機(jī)溶劑提取產(chǎn)生的未丟棄的上清液凍干，在25mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中溶解，然后裝入150μL組合肽配體庫微珠柱中，如前所述，微珠柱在相同的緩沖液中平衡，以獲得微珠和未結(jié)合部分。

最后，將尿液餾分保存在-80℃，直至質(zhì)譜分析。所有尿液餾分的蛋白質(zhì)濃度均用布拉德福德法估算。

2.2動態(tài)光散射

使用Zetasizer nano ZS90粒度儀以90°固定角度測量外泌體的大小。粒子直徑通過斯托克斯-愛因斯坦方程計(jì)算得出。對于溶液中的粒徑測量，外泌體等分樣品在PBS:H2O(1:10)溶液中稀釋，并在25℃恒定溫度下進(jìn)行研究。分析了六個獨(dú)立的等分試樣(3男3女)，每個等分試樣取三個技術(shù)重復(fù)。使用儀器提供的分散技術(shù)軟件采集和分析數(shù)據(jù)。

2.3透射電子顯微鏡

用2%v/v多聚甲醛溶液(PBS)固定外泌體，然后將其滴在涂有碳的銅柵上，在室溫下晾干20分鐘?？焖偾逑春螅赑BS中用1%w/v戊二醛固定銅網(wǎng)，并在蒸餾水中沖洗數(shù)次。用4%w/v醋酸鈾酰和UA-甲基纖維素混合溶液對樣本進(jìn)行對比。網(wǎng)格在室溫下干燥，用Tecnai 12 G2透射電子顯微鏡觀察，然后用奧林巴斯iTEM軟件進(jìn)行分析。

2.4外泌體表面生物素標(biāo)記和二維電泳

新鮮尿液外泌體在冰冷的PBS中沖洗三次，表面用2mM的EZ-linksulfo-NHS-LC-LC-生物素標(biāo)記，4℃5分鐘。用冰冷的150mM NaCl和20mM Tris-HCl pH7.5(TBS)加100mM甘氨酸沖洗外泌體三次，以淬滅和去除過量的生物素試劑。外泌體提取物按照之前的方法在2-DE上運(yùn)行。簡單地說，將清洗和沉淀的生物素化外泌體溶解在樣品聚焦溶液中，即7M尿素、2M硫脲、4%w/v CHAPS和50mM二硫代赤蘚醇(DTE)，然后裝載到自制的pH3-10非線性軟IPG條(18厘米長、3毫米寬、0.5毫米厚)上。條帶在室溫下于聚焦溶液(即7M尿素、2M硫脲、2%w/v CHAPS、15mM DTE和0.6%v/v載體兩相溶解物雞尾酒，其中pH3.5-10間距為40%，pH4-8間距為60%)中膨脹過夜。在20℃、≤50mA的條件下對蛋白質(zhì)進(jìn)行帶狀聚焦，電壓逐漸升高，總電壓為90，000Vh。在含有6M尿素、50mM Tris-HCl pH8.8、2%w/v SDS、30%v/v甘油和微量溴酚藍(lán)的平衡緩沖液中平衡30分鐘。使用Protean II XI系統(tǒng)(Bio-Rad)進(jìn)行SDS-PAGE二維分離(T%8-16)。蛋白質(zhì)用銀染色(150μg)或轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(300μg)，并在1%(重量/體積)聚乙烯吡咯烷酮溶液(TBS)中達(dá)到飽和。然后用TBS-Tween 0.05%v/v(TBS-T)沖洗膜，并與中性葡萄蛋白(50pg/mL，Thermo Scientific)或抗ATP5B抗體(SIGMA)在TBS-T中的1%w/v BSA中孵育。化學(xué)發(fā)光用于檢測。分別使用GS-800掃描儀或VersaDoc 4000(Bio-Rad)將圖像數(shù)字化，用于整個外泌體蛋白顯像或表面生物素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)和抗ATP5B抗體檢測。使用PDQuest軟件(Bio-Rad)進(jìn)行圖像分析。

2.5質(zhì)譜分析

所有樣品均采用線性阱式四極桿(LTQ)Orbitrap Velos Pro質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。

2.6用于質(zhì)譜分析的尿樣制備

樣品在0.1mL 4%w/v SDS、50mM DTT和0.1M Tris/HCl(pH7.6)溶液中溶解，90℃5分鐘，超聲處理，然后使用30 k Vivacom過濾裝置按FASP程序處理。簡而言之，將50μL等分樣品與0.2mL 8M尿素和0.1M Tris/HCl(pH8.5)(UT)混合，裝入過濾裝置并在14，000g轉(zhuǎn)速下離心15分鐘。濃縮物在裝置中用0.2mL UT溶液稀釋后再次離心。離心后，濃縮物與0.1mL 50mM碘乙酰胺UT溶液混合，室溫下黑暗培養(yǎng)30分鐘，然后離心15分鐘。然后，用0.2mL pH8.5的0.1M Tris/HCl中的8M尿素稀釋濃縮物，并再次濃縮。此步驟重復(fù)兩次。然后用120μL含有1μg胰蛋白酶的40mM NaHCO3稀釋樣品。消化過夜后，過濾裝置離心20分鐘收集肽，然后用50mL 0.5M NaCl沖洗過濾裝置并離心，以抑制疏水作用。