動物模型和體內血管生成試驗：

股動脈結扎（FAL）和體內血管生成試驗按照之前的研究進行。簡而言之，用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉小鼠，并切除它們的后肢。體溫保持在37.0±0.5°C。通過一個2毫米的切口暴露左股動脈，切口不牽拉，盡量減少對組織的干擾。在股外側尾動脈和上淺動脈起源的遠端以及股動脈的近端（腹股溝韌帶下方）放置一個7-0結扎。在縫線之間橫斷股動脈并分離1-2毫米，用生理鹽水清洗傷口并密封。最后，注射丁丙諾啡（0.05-0.1毫克/千克）。

為了評估培養(yǎng)的EPCs的血管生成能力，將不同組（包括GPR4上調組和GPR4基線組）的EPCs（5×105個細胞）重懸于100-200μl的預熱PBS（37°C）中，然后移植到結扎動脈附近的5個部位。安慰劑小鼠也注射相同體積的PBS。使用激光多普勒成像儀檢測后肢皮下血流。分別在注射后0、3、7、14和21天測量缺血和非缺血后肢的血流量。21天后，小鼠被處死。肢體缺損評分按以下等級計算：0=無，1=趾尖壞死，2=趾部壞死，3=足部壞死，4=腿部壞死，5=整條腿缺失。

免疫組化和免疫熒光分析：

免疫組化染色如前所述。簡言之，進行右股動脈結扎和股淺動脈（SFA）切除。在0.01M檸檬酸鈉緩沖液（pH6.0）中通過微波爐加熱進行復水和抗原回收。按照制造商的說明，用兔單克隆PECAM-1抗體孵育切片，然后用HRP抗兔DAB檢測試劑盒檢測。使用光學顯微鏡獲取免疫組織學圖像。血管密度通過計數(shù)CD31切片免疫組化染色中的血管數(shù)量確定，并以每平方毫米血管數(shù)表示。

為了進行免疫熒光分析，所有切片都用一抗在4°C孵育過夜，然后用GFP結合物山羊抗兔二抗染色。為了評估不同組的細胞增殖情況，手術后2周內每天兩次皮下注射，組織切片也用Cy5結合的抗BrdU抗體（Sigma）染色，以評估毛細血管密度。細胞核用DAPI反染。使用共聚焦顯微鏡獲取免疫熒光圖像。

Real-timePCR檢測：

用高純度RNA分離試劑盒提取總RNA。使用PrimeScript®RT試劑盒合成第一鏈cDNA。使用StepOnePlus實時PCR系統(tǒng)，采用2-ΔΔCT分析方法對該家族的mRNA表達進行量化，一式三份。GPR4的PCR引物如下：正向5′-AACCTCTATCGGGTGTTCGTG-3′，反向5′-TTGGCTGTGCTGTTCCTCTTGG-3′。擴增GAPDH作為內標。用2(-DeltaDeltaC(T))法測定每個樣本中的相對RNA水平。

液滴數(shù)字PCR檢測：

液滴數(shù)字PCR（ddPCR）和基于EvaGreenChemistry的數(shù)據(jù)分析按照生產(chǎn)商的說明進行。Supermix(2X)購自美國Bio-Rad。PCR中引物的最終濃度為200nM，最終反應體積為20μL。每個反應有1μLcDNA，NTC時加入1μL無核酸水代替cDNA。使用BioRad自動液滴發(fā)生器生成液滴。PCR條件如下95℃5分鐘，50℃30秒，56.5℃30秒，72℃45秒。最后在72℃延伸5分鐘，然后在4℃5分鐘和90℃5分鐘進行信號穩(wěn)定步驟。PCR結束后，使用QX200液滴閱讀器分析液滴，并使用Bio-RadQuantaSoft軟件分析數(shù)據(jù)。

Western印跡分析：

細胞在添加了1-mMPMSF的RIPA緩沖液中裂解。蛋白提取物經(jīng)SDS-PAGE處理后轉移到聚偏氟乙烯膜上。使用以下抗體：兔抗GPR4抗體、抗VEGFA抗體和兔抗GAPDH抗體。蛋白用HRP結合的抗兔IgG顯色，然后使用ECL化學發(fā)光系統(tǒng)顯色。

統(tǒng)計分析：

所有結果均表示為標準差±均值，通過學生t檢驗或方差分析評估統(tǒng)計學顯著性。P<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。所有統(tǒng)計分析均使用SPSS統(tǒng)計軟件（SPSS版本21.0）進行。

結果：

1.表型特征

圖1：培養(yǎng)28天后EPC的表型特征。a通過流式細胞術確定EPC的細胞表面標記。B EPC對DiI-acLDL攝取和FITC標記的UEA-1結合均呈陽性。細胞核用DAPI（藍色）染色。c循環(huán)EPCs在培養(yǎng)后不同時間點（第0天、第7天和第28天）的形態(tài)變化序列。

共有20人參加了研究，其中CAD組和健康組各有10人。兩組基線特征無明顯差異。晚期EPC由培養(yǎng)28天的PBMNCs獲得（圖1c），與之前的研究類似。培養(yǎng)28天后，通過流式細胞術分析培養(yǎng)的EPCs的標記蛋白，包括KDR、CD31和CD144（圖1a），EPCs的DiI-acLDL攝取和FITC標記的凝集素-1結合均為陽性（圖1b）。

2.不同的EPC在酸性環(huán)境中具有不同的血管生成能力

圖2：不同pH環(huán)境對來自非CAD和CAD患者的EPC血管生成的影響。a,b不同pH環(huán)境培養(yǎng)6h后，EPC管形成（a比例尺=40μm）和遷移（b比例尺=20μm）的代表性照片和定量分析。c來自非CAD或CAD后肢缺血的EPC介導的新生血管的代表性照片和定量分析。D HE、IHC-CD31、IF-CD31和BrdU染色的后肢缺血切片，以及CD31陽性血管、CD31陽性微血管和BrdU陽性細胞的定量分析。

為了確定不同患者EPC的體外血管生成能力，采用了Matrigel實驗。與在pH值為7.4的環(huán)境中相比，非CAD組的EPCs在酸刺激下的血管生成明顯增強，而CAD組的EPCs在相同處理下的結果則相反（圖2a）。傷口愈合的結果也類似（圖2b）。為了進一步探討這些結果的穩(wěn)健性，我們將非CAD組和CAD組的EPCs全身注射到后肢缺血的裸鼠體內，結果顯示，與注射CAD組EPCs的裸鼠相比，注射非CAD組EPCs的裸鼠血流恢復更快（圖2c）。后肢的免疫組化結果見圖2d。

3.EPC上質子傳感G蛋白偶聯(lián)受體的表達

圖3：非CAD和CAD患者EPCs中質子傳感GPCR家族的表達和血管生成能力。a使用dPCR測定EPCs中質子感應GPCR家族表達的mRNA水平。b,c GPCR家族蛋白質水平的代表性照片和定量分析。d dPCR用于測定不同pH環(huán)境中GPR4的mRNA水平。e不同pH值環(huán)境下GPR4表達的定量分析和代表性照片，然后用GPR4抗體進行免疫印跡。f,g用siRNA-NC或siRNA-GPR4轉染EPCs，拍攝Matrigel管樣形成試驗（比例尺=40μm）和劃痕試驗（比例尺=20μm）的代表性照片并進行定量分析。

與使用ddPCR對其他類型細胞進行的研究類似，我們的結果顯示，四種類型的質子傳感G蛋白偶聯(lián)受體亞型均在EPCs上表達，其中GPR4的表達量最高，這一點在Western印跡中得到了進一步證實（圖3a-c）。此外，ddPCR和Western印跡結果顯示，在酸性環(huán)境中，CAD患者的GRP4表達量明顯低于非CAD患者，而無論pH值如何，組間差異均未達到統(tǒng)計學意義（圖3d，e）。在使用siRNA-GRP4下調GRP4表達的CAD患者的EPCs中，我們發(fā)現(xiàn)EPCs的體外血管生成能力在酸性環(huán)境中受損，而在pH7.4環(huán)境中沒有受損（圖3f），傷口愈合試驗也得出了類似的結果（圖3g）。

4.GPR4基因轉移增強了酸性微環(huán)境中EPC的血管生成能力

圖4：GPR4基因轉移可恢復CAD患者EPCs酸性介導的血管生成。a,b EPCs在不同pH環(huán)境中培養(yǎng)6h后，管形成（a比例尺=40μm）和遷移（b比例尺=20μm）的代表性照片和定量分析。c注射EPCs后裸鼠后肢缺血血流的代表性照片和定量分析。d缺血后肢的HE、IHC-CD31和IF-CD31染色切片。

將人類GPR4cDNA克隆到真核表達質粒中。Western印跡證實了GPR4在EPCs中的轉錄和表達。與載體轉導的EPCs相比，pcDNA3.1(+)-GPR4轉導的EPCs在酸性微環(huán)境中的血管生成明顯增強，而在pH值為7.4的環(huán)境中，組間差異未達到統(tǒng)計學意義（圖4a，b）。

為了確定GPR4基因轉移對EPC介導的體內血管生成的影響，將pcDNA3.1(+)-GPR4轉導的EPCs和載體轉導的EPCs全身注射到后肢缺血的裸鼠體內。值得注意的是，與載體轉導的EPCs相比，pcDNA3.1(+)-GPR4轉導的EPCs能明顯增加裸鼠后肢皮下血流量（圖4c）。后肢的免疫組化和免疫熒光見4d。