摘要：

冠狀動脈疾?。–AD）患者的特點是血管再生能力下降，這與內皮祖細胞（EPCs）的功能障礙有關。G-蛋白偶聯受體4（GPR4）是一種質子傳感G-蛋白偶聯受體（GPCR），有助于酸性微環境中的血管新生。然而，GPR4在調節CAD患者的EPCs對缺血組織中產生的酸性的血管生成能力方面所起的作用仍完全不清楚。

評估了從CAD患者和健康人體內采集的EPC在不同pH值環境下的血管生成能力。在體外和體內分析了GPR4調節EPC介導的血管生成的功能。通過基因過表達和抑制進一步研究了其下游機制。

酸性環境預刺激可顯著增強非CAD組EPCs在體內和體外的血管生成能力，而同樣的處理方法在CAD組中卻產生了相反的結果。在四種典型質子感應GPCR中，GPR4在EPCs中的表達量最高。CAD患者的EPCs中GRP4的表達明顯低于非CAD患者的EPCs，與酸刺激無關。siRNA介導的GPR4敲除以及STAT3磷酸化的降低模擬了CAD患者的EPCs在pH6.4而非pH7.4下的功能受損。通過激活STAT3/VEGFA信號，提高GPR4的表達可恢復CAD患者的EPCs在酸性環境中介導的新血管形成。此外，阻斷STAT3/VEGFA信號通路會減弱GPR4上調對EPC介導的血管生成能力的有益影響。

本研究首次證明，GPR4的缺失是導致CAD患者EPCs質子感應和血管生成能力下降的原因。增強GPR4的表達可通過激活STAT3/VEGF信號促進EPCs新血管的形成。這一發現表明，GPR4是治療以缺血組織血管新生能力受損為特征的CAD的潛在靶點。

引言:

冠狀動脈疾?。–AD）是全球死亡的主要原因。冠狀動脈部分或完全堵塞引起的供血中斷會導致心肌缺血、心肌梗死（MI）以及隨后的功能衰退。通過新血管的有效發育恢復心肌缺血部位的血液供應可減少心肌壞死，并大大改善CAD患者的預后。先前的研究表明，內皮祖細胞（EPCs）通過招募到缺血部位并促進血管再生，有助于心肌損傷的修復。然而，EPC在缺血微環境中介導新生血管形成的控制機制在很大程度上仍然未知。

由于灌注不良，無氧糖酵解在代謝過程中占主導地位，并導致乳酸和H+濃度增加，從而導致缺血部位局部酸中毒。哺乳動物冠狀動脈結扎模型表示pH值從7.4降至5.5。因此，CAD患者的EPC在進入缺血部位時會暴露在酸性微環境中。酸性微環境可能會導致細胞外基質降解、減弱免疫反應并改變細胞和細胞間的信號傳遞。酸性細胞外pH值對血管生成過程有多方面的影響。最近的研究表明，酸性預處理可大大提高缺血部位內皮集落形成細胞的存活率和血管生成活性。然而，損傷組織內遷移的和局部的EPC對酸性的反應性較差，這又限制了CAD患者心肌缺血部位血管再通的進行。

G蛋白偶聯受體4（GPR4）是一種pH感知型G蛋白偶聯受體，在血管內皮細胞中高表達，可被缺血微環境中的質子激活。先前的研究表明，GPR4可在酸性pH值下促進血管生成，并能調節血管內皮細胞的管形成、遷移和增殖。GPR4基因敲除小鼠的血管形態發生改變，血管長度和密度減少。此外，GPR4缺失會導致內皮細胞中血管內皮生長因子受體2（VEGF2）水平降低。這些結果表明，內皮細胞介導的血管再生需要GPR4。然而，人們對GPR4是否介導缺血組織中產生的酸性反應和CAD患者EPCs的血管生成能力知之甚少。

在本研究中，我們假設GPR4是調節EPC細胞外pH響應的重要標志物，而GPR4表達的升高可以改善CAD患者EPC的血管生成功能。針對這些假設，研究人員評估了健康對照組和CAD患者的EPC上GPR4的表達水平。然后，在增強EPCs中GPR4的表達后，對其在裸鼠后肢缺血模型中的體外功能和體內血管生成能力進行了檢測。從化學生物學的新視角來看，本研究可能發現GPR4是缺血組織中EPC酸性微環境的關鍵傳感器，可作為預防和治療CAD的靶標。

材料與方法:

外周血單核細胞（PBMNC）的分離、后期EPC培養和流式細胞術分析:

如前所述，PBMNCs是通過Ficoll密度梯度離心從健康人和CAD患者身上分離出來的，而晚期EPCs則是按照所述方案培養和鑒定的。簡言之，將PBMCs培養在纖維粘連蛋白涂層的6孔板上，EBM-2（內容物：抗壞血酸0.5ml、rhFGF-B 2.0ml、肝素0.5ml、GA-1000 0.5ml、rhEGF 0.5ml、氫化可的松0.2ml、VEGF 0.5ml、R3-IGF-1 0.5ml），輔以內皮生長培養基-SingleQuots。在所有檢測中，晚期EPC都是在第3期（約28天）用培養基完全洗凈后使用的。28天后，使用CD31、Tie-2受體（BD Biosciences）和激酶插入結構域受體（KDR）分別從健康人和CAD患者體內分離的EPC均在37°C和5%CO2的EBM-2培養基中培養，培養基每48小時更換一次。

體外晚期EPC血管生成：

采用Matrigel管樣形成試驗測定EPC的血管生成能力。將Matrigel和EGM-2培養基在37°C、5%CO2條件下在96孔板中聚合1小時。每個條件組包含3個孔。最后觀察細胞，用光學顯微鏡拍攝圖像。用ImageJ軟件評估網絡面積和長度。同樣，用基因轉移技術和siRNA處理酸處理的EPC，然后進行Matrigel實驗。

體外EPC遷移的后期：

EPC遷移是通過傷口愈合試驗確定的。在6孔培養皿中培養2×105個P2代EPC。用p20移液管吸頭手動刮除細胞單層，用PBS溶液清洗一次，然后加入2毫升EBM-2，形成傷口。在37°C下培養24小時后，計數移行的細胞。同樣，用基因轉移技術和siRNA處理酸處理的EPCs，然后進行傷口愈合實驗。

酸刺激：

為制備等壓pH培養基，首先用7.5-mM HEPES緩沖EGM-2，然后用pH微電極（Unisense，丹麥奧胡斯）測量培養基的pH值，用NaOH或HCl調節到所需的pH值。為制備合適的培養基，常規EGM-2培養基在含5%CO2或20%CO2的濕潤組織培養箱中培養至少1小時。之后，測量每種培養基的pH值，分別約為7.4和6.4。

EPC基因轉移：

培養28天后，用編碼人GPR4基因的pcDNA3.1(+)（pcDNA3.1(+)-GPR4）、載體（pcDNA3.1(+)H302）或增強型綠色熒光蛋白基因（H312 pEGFP-N1）轉染細胞。H312 pEGFP-N1僅用于熒光顯微鏡檢測轉染效率。經Western印跡和后續實驗確定，pcDNA3.1(+)-GPR4或載體均不含增強型綠色熒光蛋白基因。用pcDNA3.1(+)-GPR4、載體（pcDNA3.1(+)H302）或H312 pEGFP-N1在無血清培養基中轉導人EPC90分鐘。轉導后，用PBS沖洗細胞并用酸性培養基培養6小時，然后用于后續實驗。

siRNA轉染：

使用Lipofectamine®RNAiMAX試劑按照生產商的方案用5μlGPR4-siRNA或5μlscramblesiRNA轉染EPCs48小時，然后用酸性培養基處理。轉導后，用PBS沖洗細胞并用酸性培養基培養6小時，然后進行后續實驗。