通過測量麥汁樣品在加熱到60°C時消耗溶解氧的能力，也檢查了麥汁樣品的氧化穩(wěn)定性（圖5）。早期麥汁樣品消耗氧氣的速率高于糖化結(jié)束時收集的麥汁。這與基于ESR的自旋捕獲方法觀察到的相對氧化穩(wěn)定性一致，因此證明添加乙醇和自旋捕獲劑POBN不會引起麥汁樣品氧化行為的重大變化。麥汁樣品在60°C時消耗氧氣很快。在耗氧量測量前預(yù)熱樣品會導(dǎo)致測量開始時樣品的氧含量水平差異很大。因此，最可重復(fù)的結(jié)果是在將室溫麥汁樣品加入預(yù)熱的氧測量室時開始測量獲得的。然而，這導(dǎo)致了在樣品溫度達(dá)到60°C的前10分鐘測量期間觀察到的氧氣濃度迅速變化（圖5）。

還測試了早期麥汁樣品在培養(yǎng)過程中較高的自由基形成速率是否是由于存在內(nèi)源麥芽氧化還原活性酶。脂氧合酶（LOX-1和-2）在高于65°C的溫度下失活，預(yù)計在應(yīng)用的糖化程序的最后一步中失活。在評估氧化穩(wěn)定性期間，在70°C下培養(yǎng)麥汁樣品，所有樣品的自由基形成速率大約提高了四倍。然而，在兩種培養(yǎng)溫度下，來自糖化早期低溫階段的麥汁樣品都比后期高溫糖化階段的樣品顯示出更高的自由基形成速率（圖4）。這表明早期樣品較低的氧化穩(wěn)定性很可能不是由麥芽氧化還原活性酶的作用引起的

在麥汁樣品培養(yǎng)期間的作用。然而，有可能在糖化的早期低溫階段，氧化還原酶產(chǎn)生了在麥汁加熱時產(chǎn)生自由基的前體。在這種情況下，這些潛在的前體可能在糖化的最后高溫階段被破壞，從而產(chǎn)生在ESR評估自由基形成期間加熱時不易產(chǎn)生自由基的后期麥汁樣品。

糖化過程中添加鐵：對麥汁樣品中鐵和銅水平的分析表明，最終麥汁比糖化25分鐘后收集的麥汁含有更少的鐵和銅（表1）。過渡金屬，特別是鐵和銅的存在，可以促進(jìn)金屬催化的氧化，從而降低氧化穩(wěn)定性。在醪液開始時添加鐵并不影響麥汁樣品中自旋加合物的形成（圖6），但在糖化和過濾后直接將鐵添加到麥汁中顯著增加了自旋加合物的水平。

麥汁樣品中的鐵濃度分析表明，在糖化過程中添加鐵僅略微增加了麥汁中的鐵水平，而直接向麥汁樣品中添加金屬則顯著提高了鐵濃度（表1）。這些結(jié)果表明鐵在糖化過程中被有效結(jié)合。

過氧化氫酶和超氧化物歧化酶：過氧化氫和超氧化物是啤酒氧化過程中重要的中間體。過氧化氫酶能有效去除過氧化氫，并且已證明向啤酒中添加過氧化氫酶可抑制自由基的形成。向麥汁樣品中添加過氧化氫酶（6000 CIU/L）導(dǎo)致自由基形成速率顯著降低了20%（p<0.05）（圖7）。正如預(yù)期的那樣，添加過氧化氫顯著增加了自由基的形成（圖7）。同時添加過氧化氫和過氧化氫酶降低了自旋加合物的形成速率，證明過氧化氫酶在麥汁樣品培養(yǎng)使用的高溫（60°C）下是有效的。同樣檢查了超氧化物歧化酶的效果。盡管如此，單獨添加超氧化物歧化酶或與過氧化氫酶聯(lián)合添加，與對照相比，對自由基形成速率均未產(chǎn)生顯著的正向或負(fù)向影響（p>0.05）（圖8）。當(dāng)超氧化物歧化酶與顯著較低劑量的過氧化氫酶（200 CIU/L）聯(lián)合使用時缺乏效果可能是原因。在低過氧化氫底物濃度下，如果存在合適的受體（如有機底物），過氧化氫酶能夠充當(dāng)過氧化物酶。這是由于過氧化氫酶和過氧化物酶對過氧化氫的親和力存在巨大差異。過氧化氫酶在低底物濃度下充當(dāng)過氧化物酶的可能性或許可以解釋為什么

在明顯較低劑量范圍內(nèi)沒有觀察到過氧化氫酶的效果。

討論

通過測量甜麥汁樣品在有空氣接觸加熱過程中自由基形成的傾向來評估其氧化穩(wěn)定性。自由基通過自旋捕獲技術(shù)檢測。然而，乙醇的存在對于積累濃度足以產(chǎn)生足夠強度ESR信號的自旋加合物是必要的。乙醇對麥汁中自旋加合物形成的影響表明，在麥汁加熱過程中形成了高活性自由基，如羥基自由基和烷氧基自由基。這些自由基能夠與乙醇反應(yīng)生成1-羥乙基自由基，后者被POBN捕獲（反應(yīng)1-3）。

因此，在自旋捕獲實驗中使用乙醇不僅增加了ESR可檢測的自旋加合物的形成，而且使得對高活性自由基的檢測更具選擇性。此外，加合物{}^{bullet}POBN/CHleft(CH_{3}right)OH良好的熱穩(wěn)定性允許在麥汁高溫培養(yǎng)過程中積累相對高濃度的該自旋加合物，從而產(chǎn)生高強度的ESR譜圖。在無乙醇情況下觀察到的ESR譜低強度不太可能是由于麥汁中缺乏自由基形成。在沒有乙醇的情況下，非選擇性的羥基和烷氧基自由基僅與麥汁中存在的碳水化合物、蛋白質(zhì)、多酚和其他有機成分反應(yīng)，但這些化合物衍生的自由基顯然不形成自旋加合物，或者形成的自旋加合物不如乙醇衍生的加合物穩(wěn)定。羥基自由基與碳水化合物的反應(yīng)通常不具有選擇性，可能導(dǎo)致多種產(chǎn)物，包括解聚和開環(huán)產(chǎn)物。

已證明氧是自由基形成所必需的。酶促反應(yīng)，如脂氧合酶活性，在本研究麥汁加熱過程中發(fā)生的氧化過程中很可能作用可忽略，因為它們在高于65°C的溫度下失活。生物系統(tǒng)中羥基和烷氧基自由基的產(chǎn)生通常與鐵和銅離子的存在密切相關(guān)，這些離子能夠通過芬頓反應(yīng)（反應(yīng)4）將過氧化物轉(zhuǎn)化為這些自由基。

有機過氧化物ROOH（如蛋白質(zhì)過氧化物）可能通過類似反應(yīng)與Fe(II)反應(yīng)，產(chǎn)生烷氧基自由基（反應(yīng)5）。

相應(yīng)地，向麥汁樣品中添加Fe(II)確實增加了自旋加合物的形成。值得注意的是，在糖化開始時添加鐵并沒有增加麥汁樣品中的鐵含量。顯然，麥汁中的高鐵含量通過其與固形物的有效結(jié)合而被阻止檢測到，這些固形物在糖化室的過濾或壓濾過程中被去除。

羥基和烷氧基自由基的形成表明過氧化物作為前體存在于麥汁中。因此，向麥汁中添加過氧化氫增加了自由基的形成，而過氧化氫酶（即使在麥汁培養(yǎng)使用的高溫下也能非常有效地去除過氧化氫）能夠阻止由添加過氧化氫引起的額外自由基形成。然而，在麥汁培養(yǎng)期間單獨添加過氧化氫酶對麥汁中自由基的形成速率有顯著影響，將其降低了20%。這表明以過氧化氫為試劑的芬頓反應(yīng)（反應(yīng)4）并非麥汁中氧化事件唯一的反應(yīng)機制。此外，添加SOD對麥汁中的自由基形成沒有正向或負(fù)向影響，這表明超氧化物在有氧氧化過程中不是重要的中間體。

兩種機制可能解釋自由基的形成無需游離過氧化氫或超氧化物作為中間體。有人提出，高活性氧酰離子（ferryl ions）Fe^{IV}=O可以通過氧作為雙鐵-氧絡(luò)合物結(jié)合（反應(yīng)6-8）的機制產(chǎn)生。已經(jīng)表明，過氧化氫酶和SOD僅能部分防止鐵自氧化過程中氧化物種的形成。這些物種中的一些，非常可能包括氧酰離子Fe^{IV}=O，取決于存在的螯合劑，能夠?qū)⒁掖佳趸?-羥乙基自由基，后者已被檢測為自旋加合物。

可以提出另一種機制，其中源自有機化合物（如碳水化合物或蛋白質(zhì)）的烷基自由基捕獲氧氣形成過氧自由基（反應(yīng)9）。麥汁中還原性化合物（如多酚）的存在導(dǎo)致過氧自由基快速轉(zhuǎn)化為氫過氧化物（反應(yīng)10），后者是形成烷氧基自由基的前體（反應(yīng)5）。烷氧基自由基隨后與碳水化合物或蛋白質(zhì)反應(yīng)，形成新的烷基自由基（反應(yīng)11）。

根據(jù)目前的結(jié)果，無法區(qū)分這些機制。然而，這兩種機制很可能并行發(fā)生，其中通過反應(yīng)6-8產(chǎn)生的氧酰離子與碳水化合物或蛋白質(zhì)反應(yīng)，形成捕獲氧氣（反應(yīng)9）的烷基自由基。

麥汁樣品加熱后立即形成自由基，這與貯藏啤酒（lager beer）形成對比，后者通常觀察到自由基形成前有一個滯后期。貯藏啤酒風(fēng)味穩(wěn)定性與這些自由基形成滯后期長度之間存在良好的相關(guān)性。滯后期被認(rèn)為是由于促氧化成分和抗氧化劑（如亞硫酸鹽）的競爭效應(yīng)所致。啤酒中的亞硫酸鹽可以有效淬滅過氧化物，而過氧化物是自由基形成的重要前體。麥汁中自由基形成缺乏滯后期，表明麥汁中的內(nèi)源抗氧化劑僅能淬滅一部分自由基，留下大量自由基參與有害的氧化反應(yīng)。在麥汁過濾（mashing-off）時向麥汁中添加亞硫酸鹽未觀察到自由基形成的滯后期，表明亞硫酸鹽在麥汁中會快速衰減。

在本研究中，使用甜麥汁中自旋加合物形成的初始速率來量化和研究糖化過程中氧化反應(yīng)的發(fā)生程度。然而，需要進(jìn)一步研究來評估啤酒釀造早期步驟中氧化的影響如何受到后續(xù)釀造步驟的調(diào)節(jié)，最重要的是，它們?nèi)绾斡绊懽罱K啤酒產(chǎn)品的質(zhì)量。這包括進(jìn)一步研究過氧化氫酶促進(jìn)的甜麥汁自旋加合物初始形成速率降低對最終啤酒風(fēng)味穩(wěn)定性的影響。