3.2緩慢生物降解的皮下鎂植入物對H2的透皮感應(yīng)

圖3、AZ31植入皮下1周后，對麻醉裸鼠進行H2測量。(a)標(biāo)有測量點并編號的小鼠照片。(b)與(a)中編號點相對應(yīng)的瞬間電流反應(yīng)。(c)根據(jù)校準(zhǔn)曲線測定的各點H2濃度。BL是在空氣中的測量值。(d)AZ31(N=3)在為期8周的研究期間每周監(jiān)測的H2濃度。每只小鼠以植入物正上方為中心進行一次測量。

我們還研究了一種腐蝕速度較慢的鎂合金AZ31，它產(chǎn)生H2的速度太慢，無法形成明顯的空腔。如圖3a所示，在小鼠身上看不到H2氣穴，只有一個凸起顯示植入的鎂圓盤的輪廓。沒有氣穴證實了AZ31的生物降解比Mg8H慢得多。圖3b-c顯示了與Mg8H合金類似，從頭部到尾部以及整個植入?yún)^(qū)域的各種測量點的實時傳感器響應(yīng)和氫含量。重要的是，植入的AZ31降解產(chǎn)生的H2通過皮膚滲透，盡管電流水平低得多，但H2微型傳感器仍然可以輕松測量。從圖3b-c可以看出，通過植入物中心正上方皮膚的H2濃度最高。

雖然植入物附近邊緣區(qū)域的H2濃度較低，但仍能獲得可測量的信號。在植入的AZ31(6號點)中心上方的皮膚上，電流高達171pA(36.4μM)；5號點和7號點的電流分別降至66pA(29.6μM)和62pA(29.2μM)。隨著與植入物距離的增加，檢測到的H2濃度降低。在頭部區(qū)域(點1)，檢測到的H2濃度很低，與未植入任何生物降解植入物的小鼠血液中的濃度相似。同樣，在點2-4和點8-9檢測到的H2濃度也很低。從這些測量結(jié)果中可以清楚地看到，盡管H2的濃度很低，但即使沒有觀察到氣泡，也能檢測到H2通過皮膚的滲透。這一觀察結(jié)果表明，H2在皮膚中的傳輸速度非?？臁Ｋ€證實，即使在看不到氣穴的情況下，植入物降解過程中也會釋放出H2。

在合金保持植入狀態(tài)的2個月期間，采用與上述Mg8H相同的程序?qū)2含量進行了監(jiān)測。圖3d中的結(jié)果顯示，與Mg8H(圖2d)相比，2個月內(nèi)H2濃度的下降幅度相對較小。盡管降幅較小，但使用學(xué)生t檢驗進行的統(tǒng)計評估顯示，在95%的置信水平下，第一次和最后一次測量結(jié)果之間存在顯著差異。這表明在2個月的時間里，腐蝕速率始終如一，只是逐漸降低。與Mg8H相比，AZ31的腐蝕速度較慢，因此H2濃度的下降幅度較小。由于AZ31在腐蝕過程中產(chǎn)生的H2氣體要少得多，因此沒有必要每周釋放氣泡。此外，與腐蝕速度較快的Mg8H樣品相比，AZ31樣品上的Mg(OH)2和MgCO3腐蝕層要薄得多。

3.3生物降解非?？斓钠は骆V植入物對H2的透皮傳感

為了進行比較，還對腐蝕速度極快的合金ZK40進行了研究。如圖S2所示，更快的腐蝕速度會釋放出更多的H2，從而導(dǎo)致傳感器發(fā)出更高的信號。在ZK40中，氣泡中心的H2傳感器電流高達620pA(360μM)，遠(yuǎn)高于類似位置的AZ31(171pA，36.4μM)。氣泡邊緣區(qū)域的H2傳感器電流也較高，ZK40和AZ31分別為249pA(197μM)和121pA(140μM)。

圖S2d顯示了2個月期間ZK40的H2濃度。與植入后第一周相比，ZK40的H2濃度在8周前下降了近75%。這種腐蝕速度最快的合金顯示出最高的H2初始濃度和8周內(nèi)最大的降幅。

比較三種合金，三種合金在研究開始時產(chǎn)生的最大H2濃度和2個月期間H2的減少百分比都按照ZK40>Mg8H>AZ31的順序減少。這與根據(jù)重量損失確定的腐蝕速率一致。此外，對于腐蝕速度較快的植入物來說，取出的合金上的沉淀層要厚得多。

根據(jù)這些使用不同合金的小鼠的實驗結(jié)果，可以看出腐蝕速度較快的鎂植入體在一定時間內(nèi)產(chǎn)生的H2更多，導(dǎo)致空腔尺寸更大，電極測量到的植入體上方小鼠皮膚中滲透的H2濃度更高。因此，H2電化學(xué)傳感器似乎可以通過無創(chuàng)程序檢測不同鎂合金在體內(nèi)的相對生物降解率。

3.4 H2電化學(xué)傳感器測量與腐蝕速率的相關(guān)性

圖4、三種合金在植入2個月后重量減輕百分比與植入第一周后氫電極在體內(nèi)測得的最大H2濃度的相關(guān)性。誤差為三只小鼠(N=3)測量值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

為了確定H2微電極的測量結(jié)果與合金腐蝕速率的相關(guān)性，我們根據(jù)植入2個月后的重量損失來確定實際腐蝕速率。圖4顯示了氫氣微電極在空腔中心或植入樣品正上方測得的最大H2濃度與重量損失的比較。重量損失測量結(jié)果表明，2個月期間的腐蝕速率順序為ZK40>Mg8H>AZ31，ZK40的生物降解速度比AZ31快得多。ZK40、Mg8H和AZ31的重量損失分別為75.0%、32.5%和2.4%。從圖中可以看出，測得的最大H2濃度與重量損失百分比成正比，這在意料之中，因為生物降解率越高，產(chǎn)生的H2就越多。圖4所示的H2測量值是在植入一周后記錄的。與研究期間其他時間的測量結(jié)果相比，此時進行的測量結(jié)果與H2水平和重量損失之間的相關(guān)性最好。這種方法避免了以下并發(fā)癥：每周例行從空腔中釋放氣體以緩解小鼠的不適感；兩個月內(nèi)由于植入體表面形成Mg(OH)2和MgCO3腐蝕層而導(dǎo)致的腐蝕速度減慢；植入體的質(zhì)量(尤其是腐蝕速度較快的合金)減小；以及由于時間安排問題而導(dǎo)致的測量時間間隔的變化。

作為動物實驗方案的一部分，每周都會測量氣腔的大小。氣腔體積是根據(jù)使用游標(biāo)卡尺測量的皮膚表面尺寸估算的。然而，氣腔體積與傳感器獲得的H2濃度之間的相關(guān)性很差。我們將此歸因于氣腔中的H2每周都會釋放，以保證試驗動物的舒適度。

總的來說，隨著腐蝕速度的減慢，H2濃度在研究過程中會逐漸降低。在整個研究過程中，緩慢腐蝕的AZ31所測得的H2含量每周都相對穩(wěn)定，而快速腐蝕的ZK40合金的H2含量則從研究開始到研究結(jié)束(大部分鎂已腐蝕)大幅下降。

4總結(jié)

由于H2通過皮膚的傳輸速度非常快，因此可以在小鼠皮下植入的生物降解鎂樣品上方的皮膚表面經(jīng)皮測量H2的濃度。雖然濃度很低(在這些研究中約為30-400μM)，但電化學(xué)H2微電極的檢測限足以輕松測量這些濃度。測量非常迅速，氫氣微電極只需約30秒就能達到穩(wěn)定讀數(shù)。測量到的H2含量與植入2個月后的樣本重量損失所確定的腐蝕率相關(guān)。因此，H2微電極有望成為監(jiān)測體內(nèi)鎂合金生物降解的有效手段。與傳統(tǒng)的生物降解率監(jiān)測方法(如取出樣品的重量損失、X射線測量和顯微CT)相比，氫氣電極具有優(yōu)勢。與失重法相比，它可以測量當(dāng)時的生物降解率，而不是整個植入過程中的綜合生物降解率。與X射線和顯微CT相比，該儀器的成本要低得多，而且不會受到輻射。經(jīng)皮感應(yīng)H2的主要基本限制是H2從植入物到皮膚表面的最大組織深度，即H2可以滲透到足夠高的濃度，從而通過將微電極尖端按壓到皮膚上進行檢測。因此，這種技術(shù)可能不適用于大腿骨等深層植入物，因為在深層植入物中需要通過厚厚的肌肉層進行滲透。由于動物的身體差異，適用性也會有所不同。實際考慮因素包括需要以適當(dāng)?shù)拈g隔用H2標(biāo)準(zhǔn)定期校準(zhǔn)微電極，以確保測量的準(zhǔn)確性。此外，H2微型電極的膜滲透性會隨著時間的推移而發(fā)生變化，導(dǎo)致靈敏度在幾個月內(nèi)下降高達50%。

總之，這些結(jié)果為常規(guī)H2測量奠定了基礎(chǔ)，可作為鎂制設(shè)備體內(nèi)測試的一部分。H2微電極可快速測量植入物(如用于修復(fù)斷臂、手腕、腿、腳踝、腳或下顎的鋼板)生物降解過程中產(chǎn)生的透皮H2水平，因為金屬直接位于測試動物的皮膚下。

該技術(shù)在人類患者身上的應(yīng)用取決于H2必須通過的植入物上方生物組織的深度和滲透性。人類皮膚一般比小鼠皮膚厚，滲透性也較差。小鼠皮膚(表皮和真皮)的厚度約為200-500μm，在某些部位，如眼瞼和頸部(380-700μm)，與人類皮膚的厚度接近。人類皮膚的表皮平均厚度為83.7μm，而小鼠皮膚僅為9.4-13.3μm；人類皮膚的真皮平均厚度為908-1339μm，而小鼠皮膚僅為200-500μm。主要的滲透屏障是最外層，即角質(zhì)層。

如果我們根據(jù)嚙齒類動物角質(zhì)層對低分子量溶質(zhì)的滲透性比人類角質(zhì)層高3-4倍這一常見的經(jīng)驗法則，并進一步假設(shè)人類皮膚和小鼠皮膚的毛細(xì)血管和淋巴管通暢度相當(dāng)，那么初步估計，植入物剛好位于皮膚表面下方的人類受試者皮膚表面的H2逸出率將比在小鼠身上觀察到的低3-4倍。這一預(yù)測表明，使用現(xiàn)有的H2微電極仍然可以測量到H2。由于這一估計值包含多個假設(shè)，因此值得進行實驗驗證。因此，預(yù)計經(jīng)皮H2測量對于直接植入皮下(如手背和腳背、手指和腳趾等附屬器官以及手臂等接近表面的骨骼部位)是有效的。對于較深的植入物，特別是H2必須通過肌肉與血管滲透的地方，H2的反應(yīng)會減弱，而血管會將H2帶走。這種方法具有無創(chuàng)的特點，而且操作簡單，因此可用于對人體皮膚附近植入物的生物降解率進行護理點測量，作為愈合過程中醫(yī)生辦公室例行檢查的一部分。