2實驗方法

2.1植入材料。

鎂合金ZK40(含Mg-4wt%Zn-0.5wt%Zr-1.4wt%Cu0.2wt%Fe-0.3wt%Mn-1.8wt%Ni-0.7 wt%Si)是通過之前描述的方法制備的。含2.5-3.5wt%Al、0.6-1.4wt%Zn和0.2-1.0wt%Mn(其余為Mg)的AZ31合金購自Goodfellow。合金的加工方法基于之前的方法。高純鎂單晶Mg8H的典型制備方法如下。主要工具是CVD設備公司制造的晶體生長器。純度為99.95%的初始多晶鎂被用作生長單晶的原料。使用一個錐形石墨坩堝來盛放熔融材料，坩堝外部的支架由特殊等級的不銹鋼制成。生長過程在氬氣流下的垂直石英管中進行。石英管周圍是一個垂直晶體爐。熔爐有兩個溫度區，以便在坩堝中形成并控制適當的溫度梯度。熔體浸泡8小時，以實現完全均化。之后，在適當的熱梯度下，通過控制爐腔的退出，從熔體中生長出單晶體。這種技術被稱為布里奇曼-斯托克巴格方法。本研究使用了一個典型的鎂單晶體，其長度為45毫米，直徑為6.5毫米，取向接近(0001)。通過放電加工(EDM)將晶體切割成直徑5毫米、厚度2毫米的圓盤。在異丙醇中使用600粗細度和1200粗細度的碳化硅紙對圓盤進行手工拋光。每次拋光后，將單個圓盤在乙醇中超聲2分鐘，然后風干。

2.2實驗室小白鼠操作規程。

特異性無病原體雌性無胸腺裸鼠購自哈蘭實驗室，在8-10周齡時使用。為了探索宿主對AZ31、ZK40和Mg8H樣品的急性反應，進行了一項體內小鼠皮下研究。小鼠植入試驗在辛辛那提大學進行(3只小鼠/樣品類型)。在該試驗中，從AZ31、ZK40和Mg8H合金樣品中切下直徑為5毫米、厚度為1.4毫米的圓片。然后將圓盤樣品在丙酮中超聲并風干。滅菌時，將顆粒在70%的乙醇中浸泡5分鐘，用杜氏磷酸鹽緩沖鹽水(DPBS，KCl2.7mM，KH2PO4(1.5mM)，NaCl(138mM)，無水Na2HPO4(8.1mM)，pH7.0)沖洗，然后在紫外線下照射圓片兩側各20分鐘。將健康的裸鼠飼養在受控條件下，并提供標準飲食和水。用異氟烷對所有小鼠進行麻醉，然后在小鼠背部做一個小的皮膚切口，形成一個皮下口袋。將鎂合金插入袋中，然后用手術釘縫合切口。兩個月后，小鼠在二氧化碳環境下被處死，并取出合金以進行進一步表征。

2.3用H2安培傳感器測量H2。

使用H2微電極(尖端直徑50μm，H2-50)連接萬用表(Unisense)，在+1000mV下極化至少1小時后，進行安培H2測量。在進行每一系列測量之前，都要按照制造商的建議對H2微型傳感器進行校準。校準時，在水中通入高純度H2氣體，直到H2達到飽和。然后，用去離子水將飽和H2水溶液稀釋到不同濃度。對于每種溶液，根據飽和百分比(0%、20%、40%、60%、80%和100%飽和溶液)進行6次測量。穩態電流根據每次測量的穩態信號數據點的平均值計算得出。氫飽和水在室溫下為0.8mM；因此，稀釋后的含氫溶液是根據其飽和度百分比計算的。每次測量時，將氫傳感器尖端浸入H2校準液中3分鐘，繪制電流與H2濃度的校準曲線。根據校準圖將體內測量值轉換為H2濃度。

在體內測量時，使用微型機械手定位微型傳感器。測量方法是將微電極尖端觸碰氣腔上方靠近植入區域的皮膚，以及圖中所示的其他位置。作為對照，在遠離氣腔的區域(如尾部)的皮膚上進行測量。利用從已知的H2飽和水含量生成的校準曲線，將從H2傳感器獲得的電流轉換為H2濃度(見上文)。

2.4 H2微電極用于小鼠皮下鎂植入物H2的透皮感應。

使用電化學傳感器檢測H2，在工作電極上施加恒定電位，測量產生的電流(安培傳感器)。氫在傳感器內部的鉑電極上通過電化學氧化成質子而被檢測到：H2→2H++2e-。

微電極的頂端非常小(直徑50μm)，因此可以在一個精確的點上進行測量。頂端有一個硅橡膠膜塞，H2通過硅橡膠膜塞才能被檢測到。這一特點使傳感器對H2具有極高的特異性。其檢測限(0.01%，水中0.1μM)非常低，足以輕松測量這些實驗所涉及的極低濃度的H2。

使用該微電極進行每次體內測量時，都要用圖1所示的可精確調節的微型定位器將微電極尖端輕輕按壓在麻醉小鼠的皮膚上。這一測量過程與我們之前的報告中描述的無創測量類似。每次測量大約需要30秒鐘才能獲得穩定信號。不過，為了獲得最穩定的H2信號和更精確的測量結果，測量時間應為3分鐘或更長。在進行每一系列測量之前都要對微電極進行校準，之后立即再次校準，以確保微電極的響應沒有偏移。

3結果和討論

3.1通過皮下鎂植入物的生物降解介質對H2進行透皮感應

圖2、植入多晶Mg8H皮下1周后，對麻醉裸鼠進行H2測量。(a)標有測量點并編號的小鼠照片。(b)與(a)中編號點相對應的瞬時電流反應。(c)根據校準曲線確定的各點測得的H2濃度。BL為空氣中的測量值。(d)在對Mg8H(N=3)進行為期8周的研究期間，每周監測一次H2濃度。每只小鼠以植入物正上方為中心進行一次測量。

首先利用Mg8H多晶合金探索了透皮H2傳感技術。這種合金的生物降解速度非常快，足以產生足夠多的H2氣體，在小鼠皮下植入時形成突出皮膚的可見氣穴。這種合金的氣穴在植入后24小時內就變得清晰可見，并逐漸增大，直至變得相當大。所有合金在植入后每周進行一次H2測量(見下文)。圖2a顯示了一只裸鼠在植入Mg8H盤一周后的氣腔情況。由于氣穴尺寸非常大，出于對動物安定的考慮，氣體在1周后被釋放。

如圖2a所示，在小鼠身上多個位置(空腔上、緊鄰空腔處和遠離空腔處)定位微電極尖端的反應如圖2b所示。通過空腔頂部小鼠皮膚滲透的H2會產生大量信號，很容易被檢測到。我們之前的研究表明，這些氫氣水平代表了空腔內的H2濃度。在圖2a所示各點測量到的H2濃度提供了H2通過皮膚滲透的"地圖"。

噪聲部分是由于H2安培傳感器在小鼠皮膚上移動到不同位置時產生的運動造成的。每個測量點的電流平均響應通過校準曲線轉換為電流中的H2濃度后，以圖表形式顯示在圖2c中。誤差為三只小鼠(N=3)測量結果的標準偏差(見下文)。正如預期的那樣，當微電極針尖直接放置在種植體周圍的空腔上時，H2含量最高(100-200μM)(3-6點和11-15點)。根據微電極尖端放置在腔隙上的具體位置，H2存在一定的差異。這種變化可能是由于氣體膨脹導致的皮膚厚度變化或腔內部結構變化造成的，這在早些時候已有報道。

當氫氣電極尖端移離空腔時，仍能從緊鄰空腔的皮膚中檢測到H2，但濃度要低得多(第16-17點)。對頭部和尾部(第1、2和7-10點)的測量結果顯示，信號略高于在空氣中測量的空白值。在尾部和頭部等遠離植入物的地方測得的H2濃度較低，為1.0-7.3μM，這是因為食物消化過程中的需氧細菌產生了背景信號。在未植入植入物的對照組小鼠體內測量的H2濃度顯示，在所有測量點，包括在測試小鼠背部植入植入物的區域，H2濃度都非常低。對照組小鼠和距離植入物較遠的測試小鼠體內的這一背景水平也與文獻報告中1.0μM的氫濃度一致。這一觀察結果表明，雖然氫氣濃度很低，但通過血管系統運輸到體內的氫氣還是被檢測到了。

為了測試腔體上特定點H2測量的可重復性，在使用和不使用顯微機械手(手持)的情況下對同一點進行了H2測量。使用微型機械手進行的六次測量得出的平均值為261±17pA，而用手進行的四次測量得出的平均值為243±19pA。這些結果表明，特定點的H2測量值具有很高的重現性，手持測量的效果幾乎與使用顯微機械手測量的效果一樣好。為了獲得最佳精度，必須以可重復的方式將微電極尖端輕輕按壓在小鼠皮膚上。由于H2在空氣中的擴散速度較快，因此在微電極尖端略高于皮膚表面的情況下進行的測量得出的數值較低。這些結果表明，經皮檢測H2確實具有可重復性。

這種檢測體內生物降解的非侵入性方法的一個主要優點是能夠對同一只動物在一段時間內進行重復測量。通過對三只小鼠(N=3)進行為期兩個月的H2監測，證明了這一點。每周測量一次植入Mg8H上部皮膚中心的H2濃度。從圖2d可以看出，前3周的H2濃度相似，然后隨著時間的推移而降低。與第一周相比，8周時的H2濃度下降到50%。隨著時間的推移，H2濃度下降的原因預計是Mg(OH)2和MgCO3在植入物表面形成了越來越厚的腐蝕層，導致腐蝕速度減慢。