斑馬魚胚胎對氧化石墨烯的吸收和線粒體損傷

圖3、斑馬魚胚胎對氧化石墨烯的吸收和定位。(A)通過共聚焦顯微鏡實時監測氧化石墨烯-F在活體胚胎(24hpf)中的運輸情況。將胚胎放入含有或不含氧化石墨烯-F的E3溶液中培養。經過8分鐘的暴露期后，氧化石墨烯-F進入胚胎。紅色箭頭表示氧化石墨烯-F，藍色箭頭表示胚胎的詳細視圖。(B)10hpf時絨毛和胚胎對氧化石墨烯的吸收。紅色、綠色和黃色箭頭分別表示氧化石墨烯、線粒體和囊泡。氧化石墨烯附著并穿透胚胎絨毛膜(B1)。氧化石墨烯進入胚胎(B3)。B4是B3中黃色矩形的詳細視圖。Ch：絨毛膜；Ou：絨毛膜外部；In：絨毛膜內部；Po：絨毛膜孔道；Mi：線粒體；Ve：囊泡。

為了檢查氧化石墨烯向胚胎的運輸情況，用氧化石墨烯-F培養24hpf以上的斑馬魚胚胎，然后通過LSCM直接觀察。在氧化石墨烯-F培養期開始時，胚胎中未觀察到熒光(圖3A)。8分鐘后，胚胎周圍出現熒光，尤其是卵黃囊附近(圖3A)，這表明氧化石墨烯進入胚胎并選擇性地定位于卵黃囊。TEM還顯示，氧化石墨烯吸附在絨毛膜表面，滲透絨毛膜(圖3B)，并定位在卵黃囊周圍。在用氧化石墨烯處理的胚胎中觀察到許多含有氧化石墨烯聚集體的囊泡，而對照組中沒有這些囊泡(圖3B2-4)。此外，胚胎對氧化石墨烯的吸收并沒有隨著氧化石墨烯濃度的增加而增加，與使用1毫克/升氧化石墨烯處理的胚胎相比，使用10毫克/升或100毫克/升氧化石墨烯處理的胚胎對氧化石墨烯的吸收減少了。

圖3、(C)96hpf后斑馬魚胚胎中氧化石墨烯的定位。(D)胚胎中氧化石墨烯的半定量分析是通過ImageJ軟件根據氧化石墨烯聚集面積與整個圖像面積之比進行的。(E)和(F)36hpf時氧化石墨烯對胚胎線粒體的損傷。(G)胚胎中氧化石墨烯聚集體的拉曼光譜。氧化石墨烯-F：用異硫氰酸熒光素標記的氧化石墨烯；TEM：透射電子顯微鏡。

制備石蠟切片以檢測96hpf時斑馬魚胚胎中氧化石墨烯的定位情況，結果發現氧化石墨烯主要聚集在眼睛、心臟、卵黃囊和尾部周圍。此外，在96hpf時將胚胎橫切成三段，并進行TEM觀察以確認氧化石墨烯在胚胎這些區域的定位(圖3C)。結果發現，與頭部或尾部相比，胸部聚集了更多的氧化石墨烯(圖3D)。此外，線粒體有規律地分布在整個胚胎細胞中，對照組的線粒體結構緊湊，膜完整(圖3E)。然而，當胚胎暴露于1mg/L氧化石墨烯中8小時后，線粒體膜變得腫脹和松散，其完整性受到破壞(圖3F)，這表明氧化石墨烯的吸收和定位可能會導致斑馬魚胚胎線粒體受損。拉曼光譜(RS)中典型的D和G波段分別在約1355和1602cm-1處，它們反映了氧化石墨烯的無序結構和有序sp2碳結構。在本研究中，用氧化石墨烯處理過的胚胎中檢測到了D和G波段(圖3G)，這證實了上述聚集體中含有氧化石墨烯。

氧化石墨烯對死亡率、孵化、心跳、運動和形態的影響

圖4、氧化石墨烯對斑馬魚胚胎發育過程中的孵化、心跳、運動和畸形的影響。(A)在72和96hpf暴露于氧化石墨烯的斑馬魚胚胎的孵化延遲。(B)氧化石墨烯對48hpf胚胎心率的影響。使用體視顯微鏡直接監測胚胎的心率。(C)氧化石墨烯對48hpf胚胎自發運動的影響。(D)氧化石墨烯對96hpf胚胎畸形發生率的影響。在96hpf時測定典型胚胎畸形的發生率，包括心包/卵黃囊水腫、尾部/脊髓彎曲和無眼/無頭。

與未經氧化石墨烯處理的對照組相比，經氧化石墨烯處理的任何一組胚胎的死亡率都沒有明顯增加。暴露于0.01-10毫克/升氧化石墨烯的胚胎的孵化率也得到了類似的結果(圖4A)。然而，與對照組相比，用100毫克/升氧化石墨烯處理的胚胎發現了嚴重的孵化延遲：這些胚胎中只有不到30%在96hpf后孵化(圖4A)。除了在48hpf暴露于100mg/L氧化石墨烯的胚胎外，大多數暴露于氧化石墨烯的胚胎的心率都有所降低。與對照組相比，經1毫克/升氧化石墨烯處理的胚胎的心率明顯下降；但經100毫克/升氧化石墨烯處理的胚胎的心率則有所上升(圖4B)。此外，與對照組相比，用100mg/L氧化石墨烯處理的胚胎在48hpf時的自發運動明顯受到抑制(圖4C)。有趣的是，胚胎附近絨毛膜中的氧氣濃度與胚胎48hpf時的自發運動顯著正相關(R2=0.84)。

氧化石墨烯會導致96hpf胚胎出現多種發育畸形，包括心包/卵黃囊水腫、尾部彎曲和眼睛/頭部畸形。畸形的類型隨著氧化石墨烯濃度的增加而變化(圖4D)。在1毫克/升氧化石墨烯培養液中培養的胚胎表現出尾部彎曲，暴露于100毫克/升氧化石墨烯后出現眼部/頭部畸形。然而，心包/卵黃囊水腫是主要的畸形，且發生率隨著氧化石墨烯濃度的增加而增加。此外，去除絨毛后，與對照組相比，1毫克/升氧化石墨烯不會改變心率，但會顯著增加心包水腫和尾部彎曲的發生率(p<0.05)。

畸形器官的細胞凋亡和氧化應激

圖5、氧化石墨烯對96hpf后胚胎凋亡的影響。(A)胚胎特定區域凋亡的代表性圖像。箭頭表示胚胎的主要凋亡區域。(B)96hpf胚胎全身和特定區域凋亡的半定量分析。相對熒光強度通過減去胚胎的自身熒光進行調整。所有圖像中的比例尺均為20毫米。

圖6、胚胎中氧化石墨烯誘導的ROS。(A)96hpf時胚胎特定區域ROS生成的代表性圖像。箭頭表示胚胎中產生過量ROS的器官。所有圖像的比例尺均為20毫米。(B)96hpf時胚胎全身和特定區域ROS的半定量分析。相對熒光強度通過減去胚胎的自身熒光進行調整。

在96hpf時，暴露于氧化石墨烯的胚胎的眼睛、心臟和尾部區域的細胞凋亡明顯增加。此外，與對照組相比，胚胎全身和上述器官中與凋亡水平相對應的相對熒光強度顯著增加(圖5B)。胚胎全身產生的ROS呈濃度依賴性增加(圖6B)。此外，在96hpf時，用1mg/L氧化石墨烯處理的胚胎的眼睛、心臟和尾部區域的ROS水平也明顯增加(圖6B)。此外，與對照組相比，氧化石墨烯以濃度依賴的方式下調了SOD活性，并顯著增加了MDA的濃度(p<0.05)。說明氧化石墨烯誘導產生過多的活性氧，增加氧化應激、DNA損傷和細胞凋亡。

遺傳毒性

胚胎中8-OHdG的產生量隨著氧化石墨烯濃度的增加而增加，與對照組相比，1毫克/升和100毫克/升的氧化石墨烯都顯著增加了8-OHdG的水平(p<0.05)。然而，氧化石墨烯對全局DNA甲基化水平的影響是復雜的。1毫克/升的氧化石墨烯抑制了全局DNA甲基化水平，而100毫克/升的氧化石墨烯則促進了甲基化。