摘要

氧化石墨烯在生物、醫療、能源和電子應用方面顯示出巨大的潛力。由于這些應用的多樣性，氧化石墨烯不可避免地會釋放到生態系統中；然而，相應的風險在很大程度上是未知的，尤其是在胚胎發育的關鍵時期。本研究發現，氧化石墨烯主要通過羥基相互作用附著并包裹在斑馬魚胚胎的絨毛膜上，堵塞了絨毛膜的孔道，造成明顯的缺氧和孵化延遲。此外，氧化石墨烯會自發穿透絨毛膜，通過內吞作用進入胚胎，破壞線粒體，并主要轉位到斑馬魚的眼睛、心臟和卵黃囊區域，這些區域涉及斑馬魚的循環系統。在這些器官中，氧化石墨烯誘導產生過多的活性氧，增加氧化應激、DNA損傷和細胞凋亡。氧化石墨烯還會誘發眼睛發育畸形、心臟/卵黃囊水腫、尾部彎曲和心率下降。與納米粒子常見的劑量效應關系不同，隨著氧化亞石墨烯濃度的增加，其對心率和尾部/脊髓彎曲的不良影響先增加后減小。這些發現強調了氧化石墨烯對胚胎發育的特定不利影響，并突出了氧化石墨烯的潛在生態和健康風險。

引言

基于二維氧化石墨烯的材料因其獨特的物理化學特性，已引起各研究界和工業界的廣泛關注。有報告預測，到2020年，基于氧化石墨烯的產品市場規模將達到6.75億美元。遺憾的是，雖然基于氧化石墨烯的材料使用量的增加促進了它們在環境中的釋放，但與環境接觸氧化石墨烯有關的健康風險在很大程度上還不為人所知，特別是在胚胎發育方面。有關氧化石墨烯納米毒性的少量研究是在哺乳動物、生物大分子、細菌和不同的細胞系中進行的。使用體外細胞培養來初步評估納米材料的毒性相當簡單，而且成本效益高；但是，要模仿體內系統幾乎是不可能的，而且已經報道了一些有爭議的結果。盡管小型哺乳動物模型仍然是評估納米材料可能對人體產生的毒性和分布的標準方法，但建立哺乳動物模型往往成本高昂且耗時較長。因此，斑馬魚(Daniorerio)已被確立為研究納米材料體內毒性的首選脊椎動物模型，這是因為斑馬魚和人類基因組之間存在密切的同源性。此外，斑馬魚和人類表現出相似的生理反應，尤其是在慢性疾病的發展過程中。

胚胎發育是生命的一個重要階段，胚胎發育的功能障礙與各種疾病和不良影響有關，如缺氧、畸形、器官功能和蛻皮。斑馬魚胚胎是一種獨特的模型系統，可用于研究納米粒子對胚胎發生的影響；然而，迄今為止，有三個關鍵問題一直被忽視。首先，與其他納米材料相比，氧化石墨烯具有優異的機械和親水性能，同時保持高度的柔韌性和延展性。這些特性使氧化石墨烯能夠附著在單個細胞表面。此外，最近的研究表明，氧化石墨烯可以包覆活的微生物；但是，氧化石墨烯對大型胚胎的包覆以及這一過程的不利影響仍不清楚。其次，與常見的納米粒子相比，盡管氧化石墨烯納米片的厚度只有大約1納米，但它的尺寸卻相當大，長度從幾十納米到幾毫米不等。因此，氧化石墨烯滲透胚胎并轉運到特定器官的實時動態可能是獨一無二的。第三，與碳納米管(CNT)和富勒烯相比，二維氧化石墨烯納米片的結構決定了其在體內的命運和生物相容性。氧化石墨烯的特殊包覆和轉運特性可能會誘發獨特的納米毒性，因此應對此進行深入探討。

本研究的主要目的是描述氧化石墨烯納米片與斑馬魚胚胎之間的相互作用，并分析氧化石墨烯在體內的定位和不利影響。具體來說，我們確定了以下特性：(i)氧化石墨烯包覆發育中胚胎的絨毛膜及其在此背景下的缺氧效應；(ii)氧化石墨烯向胚胎特定器官的轉移；(iii)活性氧(ROS)的過度生成、細胞凋亡、DNA損傷和發育畸形之間的關系。

方法

氧化石墨烯特性

目前環境中的氧化石墨烯濃度尚不清楚。為了能夠與毒性試驗中報告的碳納米材料劑量進行直接比較，在E3胚胎培養基(5mM NaCl、0.17mM KCl、0.33mM CaCl2、0.33mM MgSO4；pH7.4)中制備了不同濃度(100、10、1.0、0.1或0.01mg/L)的氧化石墨烯懸浮液。氧化石墨烯納米片(純度>99%，單層比~99%)來自南京新納米材料科技有限公司。將100.0毫克的氧化石墨烯溶解在1000毫升的E3溶液中，然后超聲1小時，就得到了100毫克/升的氧化石墨烯水溶液。使用Agilent 5420 AFM儀器在攻絲模式下采集原子力顯微鏡(AFM)圖像。在恒定的pH值(pH7.4)下，使用配備30mW 635nm激光的ZETAPALS/BI-200SM儀器對粒度分布和Zeta電位進行表征。所有樣品的紫外可見光譜都是在配有UVW5軟件的T90分光光度計上，在200-800納米的1厘米路徑長度石英比色皿中記錄的。傅立葉變換紅外光譜(FT-IR)由布魯克Tensor27紅外光譜儀記錄，分辨率為2cm-1，波長為4000-400cm-1。為了檢測組成氧化石墨烯的元素，還進行了能量色散光譜分析。

斑馬魚和胚胎暴露于氧化石墨烯的情況在補充材料中有所描述。

氧化石墨烯暴露下的胚胎和缺氧微環境

為了研究氧化石墨烯對胚胎的包裹作用，使用日立SU8010顯微鏡進行了掃描電子顯微鏡(SEM)觀察。更多詳情見補充材料。為了研究氧化石墨烯對絨毛功能群的影響，絨毛被從胚胎中分離出來并用傅立葉變換紅外光譜進行分析。為了測量胚胎的缺氧微環境，使用Unisense氧氣微電極測量了氧氣濃度。