2.材料與方法

2.1.微生物與發酵條件

所用菌株吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)5008(CGMCC 4.1026)是一種工業上生產Val-A的菌株，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

孢子瓊脂培養基組成如下：豆粕20 g/L，麥芽糖20 g/L，瓊脂20 g/L。用2 mol/L NaOH將培養基pH調至7.0，并在121°C高壓滅菌20分鐘。在37°C培養八天后收集孢子，懸浮于20%(v/v)甘油中，-80°C保存備用。

種子培養基組成如下：玉米粉30 g/L，豆粕22 g/L，酵母提取物10 g/L，NaCl 2 g/L，KH2PO4 0.8 g/L。接種50μL孢子懸液(1.5 x 10?cfu/mL)后，在37°C，220 rpm的旋轉搖床上，在250mL搖瓶（含50 mL種子培養基）中進行預培養。

對于Val-A生產，發酵培養基組成如下：玉米粉100 g/L，豆粕25 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 1 g/L，KH2PO4 1.5 g/L。將5 mL種子培養物接種到含有50 mL發酵培養基的250 mL搖瓶中，在37°C，220 rpm下發酵5天(Zhou,et al.,2012;Zhou and Zhong,2015)。

2.2.Val-A生產的pH沖擊策略

2.2.1.不同堿性溶液進行pH沖擊

當發酵進行24小時時，分別通過添加2 mol/L NaOH、2 mol/L KOH和2 mol/L氨水，將不同處理組的發酵液pH從自然pH 6.4調節至pH 8.0。

2.2.2.pH沖擊的不同時間點

六個不同處理組的發酵分別持續4 h、8h、12h、16h、20h和24h，然后通過添加2 mol/L NaOH將發酵液pH調節至pH 8.0，進行后續培養。

2.2.3.不同處理次數

三組設置如下：

?單次pH沖擊處理：當發酵進行20小時時，通過添加2 mol/L NaOH將發酵液pH調節至pH 8.0。

?兩次pH沖擊處理：當發酵進行20小時和44小時時，用2 mol/L NaOH將發酵液pH調節至pH 8.0。

?三次pH沖擊處理：當發酵進行20小時、44小時和68小時時，用2 mol/L NaOH將發酵液pH調節至pH 8.0。

2.3.細胞重量、殘留碳源和Val-A產量的分析

每天取2mL發酵液樣品用于分析細胞重量、殘留碳源和Val-A產量。樣品在12,000g下離心5分鐘。取0.5mL上清液，用等體積的氯仿萃取，然后用0.22-μm親水性濾膜過濾。含有Val-A的過濾樣品采用高效液相色譜法(HPLC)進行分析(Iwasa et al.,1971)。由于種子培養基中的玉米粉和豆粉不溶，標準的干重法不可行，因此使用標準的Bradford法測量細胞內蛋白質以反映細胞生長(Kieser et al.,2000)。培養基中的總殘留糖（作為碳源）采用標準的苯酚-硫酸法測定(Liao et al.,2009)。

2.4.胞外和胞內pH測量

胞外pH(pHex,培養基pH)使用pH微電極計(Unisense,Denmark)測量。

胞內pH(pHi)使用pH敏感染料2',7'-雙-(2-羧乙基)-5-(和-6)-羧基熒光素乙酰氧基甲酯(2',7'-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester,BCECF-AM;Beyotime Institute of Biotechnology,江蘇,中國)測量。本研究采用雙激發比率法，借助多掃描光譜儀(SpectraMax M5,CA,USA)進行；激發波長分別為440nm和488nm，發射波長為535 nm。使用離子載體尼日利亞菌素(nigericin;Sigma,Lezennes,France)和一組pH范圍從6.5到8.5的確定的高K?磷酸鹽緩沖液進行體內校準(Corvini et al.,2000)。

2.5.DNA微陣列實驗和微陣列數據分析

使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN,Hidden,Germany)按照制造商的說明分離和純化總RNA，并使用Agilent Bioanalyzer 2100系統(Agilent,CA,USA)檢查質量和數量。使用Low Input Quick Amp Labeling Kit,One-Color對總RNA進行擴增和標記。使用RNeasy Mini Kit純化Cy3標記的cRNA。在Hybridization Oven中雜交17小時。雜交后，在Gene Expression Wash Buffer Kit中清洗載玻片，并使用Agilent Microarray Scanner G2565CA掃描微陣列。

使用Feature Extraction Software 10.7進行陣列圖像的采集和量化，并使用Quantile算法對原始數據進行歸一化處理。計算每個基因的歸一化表達比率，并使用標準fold change

>2.0且p<.05進行顯著性檢驗。采用統計學分析（t檢驗）中p值最低的變化值作為最可靠的值。為了用一個技術重復代表每種培養條件下三次測量的變異，計算了變異系數(CV)。在樣本中，至少98%的基因組產生了可檢測的轉錄本，平均變異系數不超過0.15，符合Agilent的質量控制建議。

2.6.通過定量實時RT-PCR驗證微陣列數據

使用Trizol(Invitrogen,CA,USA)提取總RNA，并用gDNA Eraser(Takara,大連,中國)處理。隨后，使用PrimeScriptTM RT reagent Kit(Takara,大連,中國)進行反轉錄。使用SYBR Premix Ex TaqTM(Ti RNaseH Plus)(Takara,大連,中國)在StepOne Real-Time PCR(Applied Biosystems)上測定基因的轉錄水平。PCR條件為：95°C預變性10分鐘，然后進行40個循環：95°C變性15秒，58°C退火60秒，72°C延伸15秒。對于每個基因，將種子階段的發酵樣品定義為表達水平1.0，結果表示為mRNA水平相對于對照樣品的倍數增加(Feng et al.,2016)。

2.7.胞內游離谷氨酸濃度的測定

使用HPLC采用茚三酮比色法測定在37°C(220 rpm)下培養兩天的菌株5008的胞內游離谷氨酸。從發酵培養基中不同時間點抽取的生物量樣品在12,000g下離心5分鐘，洗滌兩次，重新懸浮在1 mL ddH2O中，并在冰浴中通過超聲破碎（20個循環，每個循環5秒超聲，間隔10秒）。通過9000g離心10分鐘去除細胞碎片，然后將上清液與10%的水楊基磺酸(salicylsulfonic acid)混合，在-20°C下放置20分鐘，然后在12,000g下離心60分鐘分離。然后，將提取物蒸發，用1 mL 0.02 mol/L HCl重新懸浮，并用0.22μm水相濾膜過濾(Wu et al.,2012)。將20μL每個樣品注入HPLC進行谷氨酸測量。

2.8.CTC染色

5-氰基-2,3-二苯基氯化四氮唑(5-cyano-2,3-ditolyl-tetrazolium chloride,CTC)是一種可溶、不發熒光的染色劑。它可被呼吸細胞的電子傳遞鏈吸附并還原成不溶的紅色熒光物質(CTC formazan)，并在細胞中積累。因此，這種氧化還原染料已被廣泛用于確定細菌的呼吸活性。熒光強度越高代表呼吸活性越高。通過12,000g離心5分鐘從搖瓶中收集菌絲體，洗滌兩次并重懸于生理鹽水(0.9%NaCl)中。使用Bacstain-CTC快速染色試劑盒(Dojindo,Kumamoto,Japan)在1.5 mL離心管中按照說明書進行CTC染色30分鐘(37°C)(Winding et al.,1994)。將200μL染色樣品置于96孔板中，使用Multiscan Spectrum(SpectraMax M5,CA,USA)在488 nm激發波長和620 nm至640 nm發射波長下進行測量。