摘要：

眾所周知，小腸對(duì)輻射特別敏感，放療的主要限制因素是用藥后出現(xiàn)的胃腸道綜合征。輻射的有害影響主要是通過過量產(chǎn)生活性氧（ROS），尤其是羥自由基（-OH）來介導(dǎo)的。由于氫氣是一種選擇性-OH清除劑，我們假設(shè)氫氣可能對(duì)輻射引起的腸道損傷具有保護(hù)作用。在此，我們?cè)谛∈蠛湍c隱窩上皮細(xì)胞（IEC-6）系中建立了輻射模型。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，我們證明富含氫氣的生理鹽水能顯著減少輻射引起的腸粘膜損傷，改善腸道功能，提高存活率。此外，氫氣處理還減輕了輻射引起的氧化應(yīng)激損傷和全身炎癥反應(yīng)。此外，氫氣處理還能減少細(xì)胞凋亡，維持小鼠腸上皮細(xì)胞的增殖。使用IEC-6細(xì)胞系進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)表明，富氫培養(yǎng)基能顯著抑制ROS的形成，維持細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡。重要的是，氫處理可防止線粒體去極化、細(xì)胞色素c釋放以及caspase-3、caspase-9和PARP的活性。此外，Bcl-xl和Bcl-2蛋白表達(dá)的減少以及Bax蛋白表達(dá)的增加也被阻斷。

引言：

放射治療（RT）是癌癥多模式治療的一個(gè)重要方面，在根除惡性細(xì)胞方面發(fā)揮著重要作用，但也不可避免地會(huì)對(duì)正常組織造成損傷。胃腸道（GI）黏膜是對(duì)輻射反應(yīng)較早的組織，因?yàn)槠湓鲋逞杆偾页掷m(xù)不斷。據(jù)估計(jì)，大約50%的接受RT治療的患者會(huì)出現(xiàn)長(zhǎng)期慢性消化道癥狀，影響其日常活動(dòng)。

由于腸隱窩細(xì)胞增殖迅速且持續(xù)不斷，因此最容易受到輻射的影響。據(jù)報(bào)道，低至1Gy的輻射劑量可導(dǎo)致小鼠小腸隱窩細(xì)胞凋亡在輻射照射后3-6小時(shí)內(nèi)急劇增加。以往的研究表明，輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與線粒體凋亡途徑有關(guān)，線粒體凋亡途徑的特點(diǎn)是細(xì)胞色素c的釋放以及caspase9和多（ADP-核糖）聚合酶（PARP）的活性。

輻射對(duì)生物組織的有害影響主要是通過增加活性氧（ROS）的產(chǎn)生來介導(dǎo)的。研究報(bào)告指出，線粒體在放大和傳遞導(dǎo)致產(chǎn)生ROS的信號(hào)方面起著核心作用。這些自由基的半衰期極短，但它們會(huì)立即與附近的分子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生嚴(yán)重的特定部位氧化損傷，破壞細(xì)胞功能，甚至殺死細(xì)胞。在輻射產(chǎn)生的ROS中，-OH是一種高活性產(chǎn)物。據(jù)估計(jì)，輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷有60-70%是由-OH引起的。科學(xué)家們已經(jīng)證明，-OH的壽命很短，在發(fā)生反應(yīng)前僅能停留約9-10秒，擴(kuò)散約4納米。此外，-OH造成DNA損傷只需要一毫秒的時(shí)間。遺憾的是，到目前為止，還沒有已知的-OH內(nèi)源解毒系統(tǒng)。

氫氣是一種新型能源，最近大量研究都集中在氫氣作為儲(chǔ)能介質(zhì)的能力上。2007年，Ohsawa等人提供的證據(jù)表明，吸入氫氣可以通過選擇性地減少-OH來保護(hù)大腦免受缺血/再灌注（I/R）損傷和中風(fēng)的影響，這表明氫氣作為一種治療氣體，可以專門針對(duì)-OH發(fā)揮獨(dú)特的功能。由于-OH是輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的主要原因之一，而氫氣是一種選擇性-OH清除劑，因此我們利用細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)研究了氫氣對(duì)輻射誘導(dǎo)的腸道損傷的保護(hù)作用。

材料與方法：

動(dòng)物和細(xì)胞系：

雄性C57BL/6小鼠年齡為8-10周，體重為20-25克，被飼養(yǎng)在單獨(dú)的籠子里，置于12小時(shí)光照/黑暗循環(huán)的恒溫室中，可自由獲取食物和水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）發(fā)布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

腸上皮細(xì)胞-6（IEC-6）是一種腸隱窩上皮細(xì)胞系，取自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心（CRL-1592），在含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的杜氏改良老鷹培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞在37℃、5%CO2加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基每24小時(shí)更換一次。

制備富氫鹽水（Hs）和富氫培養(yǎng)基（Hm）：

氫氣在生理鹽水（Ps）或培養(yǎng)基中高壓（0.4兆帕）溶解，使用氫氣產(chǎn)生裝置持續(xù)6小時(shí)使其達(dá)到飽和濃度（大于0.6毫摩爾/升）。本研究中使用的Hs和Hm是在實(shí)驗(yàn)開始前制備的。氫氣微電極（MicroResp，丹麥Unisense公司）用于測(cè)量氫氣溶液和腸粘膜中的氫氣濃度。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

在我們的體內(nèi)研究中，第一部分用于測(cè)量體重（BW）、食物攝入量和存活率。24只小鼠被平均隨機(jī)分為兩組：輻射組（Rc組，15Gy全身輻射(WR)+Ps）和輻射加氫處理組（Rh組，15Gy全身輻射+Hs）。WR前5分鐘腹腔注射Hs或Ps（10毫升/千克體重）。每天記錄小鼠的進(jìn)食量和體重，直到小鼠開始死亡，并每隔24小時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠的存活率。

體內(nèi)研究的第二部分旨在進(jìn)行組織病理學(xué)分析和分子檢測(cè)。36只小鼠被平均隨機(jī)分為三組：Sham組（S組，無輻射但有Ps）、輻射組（Rc組，10Gy輻射+Ps）和輻射加氫處理組（Rh組，10Gy輻射+Hs）。在放射治療前5分鐘給小鼠注射Hs或Ps（靜脈注射）。三組中的六只小鼠分別在24小時(shí)和96小時(shí)接受10GyWR后安樂死。

設(shè)計(jì)了一項(xiàng)利用細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行的原位研究，以測(cè)量ROS的形成、細(xì)胞凋亡和存活率。在實(shí)驗(yàn)過程中，細(xì)胞也被分為三組：空白組（S組，無輻射+正常培養(yǎng)基）、輻射組（Rc組，6Gy輻射+正常培養(yǎng)基）和輻射加氫處理組（Rh組，6Gy輻射+Hm）。如前所述，Rh組細(xì)胞與Hm一起在充滿富氫混合氣體的密閉容器中培養(yǎng)。輻照后30分鐘、6小時(shí)和24小時(shí)分別收獲輻照細(xì)胞。

放射協(xié)議：

放射中心產(chǎn)生的60Co-gamma射線被用作放射源。小鼠或細(xì)胞均以每分鐘1Gy的速度接受輻照。在本研究中，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)使用了15Gy的致死劑量和10Gy的亞致死劑量，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)使用了6Gy的致死劑量和亞致死劑量。

檢測(cè)腸粘膜中的氫濃度：

使用氫氣微電極檢測(cè)生理鹽水、培養(yǎng)基和腸道組織中的氫氣濃度，該方法之前由Sun等人介紹過。