富氫培養基處理：

將金屬鎂棒放入DMEM/F12培養基（最終氫濃度為0.55-0.65Mm）中制成富氫培養基。使用針式氫電極（UnisenseA/S，丹麥奧胡斯）監測氫濃度。

核磁共振成像：

核磁共振成像研究使用布魯克高場小動物核磁共振成像系統進行。在2Lmin-1氧氣中用2%異氟烷麻醉荷瘤大鼠，并維持在正常體溫。在腫瘤移植后的第17天和第26天，使用常規自旋回波序列采集每只大鼠的T2加權磁共振圖像，參數如下：TR=3140ms，TE=37ms，帶寬=130Hz，翻轉角=180°，FOV=4cm×4cm，切片厚度=1mm。

組織學和免疫組化：

用石蠟包埋膠質瘤組織，然后切成8μm厚的切片。切片用3%過氧化氫處理10分鐘以滅活內源性過氧化物酶，然后用10%正常山羊血清孵育。去除阻斷血清后，切片與一抗（包括抗-CD34、抗-Ki67、抗-CD133和抗-Nestin在4°C下孵育過夜。使用HRP結合的二抗進行檢測，然后使用DAB試劑盒進行比色檢測。所有數據均由雙盲研究人員進行評估。

免疫熒光：

將細胞播種在蓋玻片上，用4%多聚甲醛固定10分鐘，用0.1%TritonX-100in PBS進行通透，并用1%BSA封閉1小時。細胞核用Hoechst染色，并用倒置顯微鏡獲得熒光圖像。

流式細胞術：

用流式細胞術分析培養細胞中CD133的表達。簡言之，在4℃下用10%馬血清在PBS中孵育細胞10分鐘，然后在4℃下用一抗CD133孵育30分鐘。離心后，收集的細胞與FITC結合的二抗孵育20分鐘。染色后，使用流式細胞儀對細胞進行流式細胞術分析。

球形成試驗：

收集并洗滌細胞以去除血清，然后以2.0×103/mL的密度懸浮于無血清DMEM或MEM/EBSS培養基中。每孔計數500個細胞，并將其播種到超低附著力六孔板上進行球形成試驗。細胞在正常無血清培養基或含B27補充劑、20納克/毫升表皮生長因子（EGF）和20納克/毫升堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）的富氫無血清培養基中培養。培養基每3天更換一次。細胞培養10天，計數直徑大于50μm的小球。

細胞遷移試驗：

采用傷口愈合試驗檢測細胞遷移能力。簡單地說，將細胞以1.0×106個/孔的濃度接種到六孔培養板中，培養24小時后，用塑料吸管尖在每個培養板的細胞表面劃一條線。用PBS沖洗剩余細胞三次，去除漂浮的細胞和碎片，然后在普通完全培養基或富氫培養基中培養48小時。分別在傷口愈合后和愈合后24小時的時間點拍攝傷口愈合過程的數字圖像。傷口愈合試驗分三個獨立實驗進行。

細胞侵襲試驗：

細胞侵襲能力的測定采用BDmatrigel侵襲室，按照生產商的方案進行。簡而言之，在帶有聚碳酸酯過濾器（孔徑為8μm）的上腔涂上50μL Matrigel（0.8μg/μL，37°C，2h）。將100μL無血清培養基中的1×105個細胞接種到上腔，然后在下腔加入650μL含氫或不含氫的普通完全培養基。然后用棉簽將上表面的細胞完全清除。下表面的細胞在固定后用0.1%（w/v）結晶紫染色，并從每個插入物中隨機抽取5個視野，在×100倍放大鏡下計數。侵襲試驗在三重獨立實驗中進行。

菌落形成檢測：

每孔計數一千個細胞并將其播種在六孔板中。在含氫或不含氫的普通完全培養基中培養14天，然后用4%多聚甲醛固定細胞，并用0.1%結晶紫染色。只有當菌落至少包括15個細胞時才進行計數。進行三重獨立實驗，所有可見菌落均以人工方式計算。

統計分析：

采用雙尾學生t檢驗比較細胞培養和體內實驗的各組數據，結果以均數±SEM表示。所有統計分析均使用GraphPadPrism6.01進行。P<0.05的值被認為具有顯著性。

結果：

1.吸入氫氣可抑制體內膠質瘤的生長

圖1：氫氣吸入還能抑制U87皮下小鼠模型的腫瘤生長（d)，腫瘤重量（e）和腫瘤體積（f）均有所下降。CTRL：對照組；HI：氫氣吸入組

圖1：氫氣吸入可抑制體內膠質瘤細胞的生長。在大鼠C6腦膠質瘤模型中，通過磁共振成像評估膠質瘤的生長情況。拍攝了具有代表性的圖像（a）并對其進行了量化（b）。氫氣吸入可延長中位生存期（c）。氫氣吸入也抑制了U87皮下小鼠模型中的腫瘤生長

分子氫對膠質瘤細胞腫瘤生長的影響首先在大鼠C6膠質瘤模型中進行了評估。磁共振成像結果顯示，在植入C6細胞后的第17天，氫化組（54.76±6.07）與對照組（51.23±9.11）的腫瘤大小無明顯差異。但在第26天，HI組的腫瘤體積比對照組明顯縮小（223.3±33.83mm3vs.363.3±34.80mm3，p=0.045）（圖1a、b）。此外，吸入氫氣還能延長中位生存期（28.00天對31.00天，p=0.0012）（圖1c）。

為了證實分子氫對膠質瘤生長的影響，我們使用了小鼠U87皮下模型。如圖1d-f所示，與對照組相比，吸入氫氣可顯著減少腫瘤重量（0.34±0.11gvs.0.79±0.11g，p=0.0078）和體積（181.30±48.02mm3vs.504.20±61.71mm3，p=0.0003）。